A parodontitisben szenvedő betegek nem sebészeti kezelésének hatása a gyulladásos mediátorokra az ínyárok folyadékában (NONSURG)

A parodontitist egy diszbiótikus mikrobiota indítja be, amely a fogfelszínt kolonizálja a parodontális zsebben, krónikus gyulladást váltva ki a parodontális szövetekben, és ezután a fogtartó szövetek pusztulásához és elvesztéséhez vezet. A súlyos parodontitis a globális népesség jelentős részét érinti, és fogvesztéshez vezethet. A gazda immunválaszai a parodontális szövetekben felelősek az eseménysorozatért, amely a csontvesztéshez vezet. A parodontitissel érintett fogíny szövetben az infiltráló immunsejtek és a rezidens fogínysejtek citokinek és mátrixbontó enzimeket termelnek a parodontopatogének eltávolítására. A fogínyárok folyadék (GCF) egy helyspecifikus exsudát, amely a gyulladt fogínyben a helyi gyulladásos folyamat tükröződése, és a GCF-ben található gyulladásos citokinek, mint például az IL-6, IFN-γ, IL-β, korrelációt mutatnak a parodontitis súlyosságával. Ezen kívül a GCF egy nem invazív és könnyen gyűjthető folyadék az elemzéshez. A kemokinok a citokinek egy speciális alcsoportja, amelyek elsősorban az immunsejtek mozgását irányítják a gyulladás helyszíneire kemotaxison keresztül. A neutrofilek honingja egy rendkívül szelektív folyamat, amelyben a specifikus neutrofil kemoatraktánsok, mint például a CXCL1, CXCL2 és CXCL8, expressziója jelentős szerepet játszik a parodontitis patogenezisében. Ezen túlmenően, a makrofágokról jelentették, hogy aktivációs spektrummal rendelkeznek, a progyulladásostól az antigyulladásosig, a parodontális betegségben. A makrofág migráció gátló faktor (MIF) kulcsszerepet játszik a makrofág homeosztázis fenntartásában. Jelentették, hogy sokféle funkcióval rendelkezik, védő és káros hatásokkal egyaránt a gyulladásos folyamatra, a csontanyagcserére, az angiogenezisre és az apoptózisra. A vaskuláris endotél növekedési faktor-C (VEGF-C) a vaskuláris endotél növekedési faktor család fontos tagja, amely felgyorsítja az ér- és nyirokerek növekedését. Továbbá, a nyirokerek növekedését (limfangiógenezis) és átalakulását kóros állapotokban a kemokinok és az érintett szöveten belüli és környezetében található nyirok endotél sejtek (LEC) által expresszált receptorok befolyásolják. A limfangiógenezis összefüggésbe hozták a parodontális gyulladással egerekben. Az emberekben a CCL21, egy ligand, amely fontos a dendritikus sejtek migrációjához, le van regulálva a parodontitises betegek nyirokrendszerében. A VEGF-C szintje rossz prognózissal függ össze a rákban, és tanulmányok jelentették, hogy az MIF és a VEGF-C expressziója erősen korrelál. A legjobb tudásunk szerint a VEGF-C expresszióját emberi GCF-ben soha nem vizsgálták. Azoknál a betegeknél, akik nem sebészi parodontális kezelést (NSPT) kapnak, a kezelés célja a gyulladás kontrollálása és a parodontális szövet gyógyulásának elősegítése a normális mikrobiota helyreállításával. Dohányosoknál korábban jelentették a NSPT utáni gyógyulási válasz akadályozottságát. Úgy tűnik, a dohányzás módosítja a mikrobiális összetételt és elősegíti a kulcsfontosságú parodontális patogének kolonizációját. Újabb bizonyítékok azt sugallják, hogy bizonyos citokinek és kemokinok a GCF-ben ígéretes biomarkerek a parodontitis patogenezisének, prognózisának és a NSPT-re adott válasz meghatározásához. Ebben a tanulmányban a kutatók elemezték a kemokinok/citokinek és a VEGF-C expresszióját a GCF-ben dohányosok és nem dohányosok súlyos parodontitisében mély zsebekben a NSPT előtt és alatt. Alapvonalon a kutatók összehasonlították ezen markerek szintjét sekély és mély parodontális zsebek között dohányosok és nem dohányosok között.

Anyag és módszerek Vizsgálati populáció: Az egyének, akiket a Nyugat-Norvégiai Szájhigiéné Szakértői Központ szakrendelésére irányítottak parodontális kezelésre, meghívást kaptak a jelen tanulmányban való részvételre. A beválasztási kritériumok azok az alanyok voltak, akiket a EFP/AAP osztályozási rendszer szerint III. és IV. stádiumú parodontitissel diagnosztizáltak. Minden jogosult résztvevőt (n=30, >16 éves) megkérdeztek dohányzási előzményeiről, és dohányosnak azonosították, ha az utolsó 5 évben dohányosok voltak. Az alanyokat kizárták, ha antibiotikum használatot jelentettek az utolsó 6 hónapban, terhességet, szoptatást, krónikus magas dózisú szteroid kezelést, sugárkezelést vagy immunuszuppresszív terápiát. Nem zárták ki, ha jól szabályozott cukorbetegséget jelentettek. A jelen tanulmányt a Nyugat-Norvégiai Regionális Orvostudományi Kutatási Etikai Bizottság (REK) jóváhagyta, 2017/1650/REK Nord. Tájékoztatott beleegyezést kértek minden betegtől a vizsgálatba való beválasztás előtt.Az elemzésben szereplő helyszínek klinikai vizsgálataA szondázási zsebmélységet (PPD), a klinikai kötőszöveti veszteséget (CAL) és a szondázáskori vérzést (BOP) mérték négy helyszínről fogonként, kivéve a harmadik őrlőfogakat, és a diagnózist egy parodontológus végezte az első szűrő látogatáson. Információkat gyűjtöttek a dohányzási szokásokról és a cukorbetegségről. A fogínyárok folyadék (GCF) mintavételét a szűrés után határozták meg, és minden betegnél egy sekély (≤4mm) és egy mély zseb (≥5 mm) volt. Csak azokat a fogakat választották ki mintavételre a NSPT előtt alapvonalon (T0), amelyek mély zsebeiről a parodontológus becsülte, hogy fennmaradnak a kezelés három időpontja után. GCF-t gyűjtöttek sekély és mély zsebekből T0-n, és mély zsebekből T1-en és T2-n a NSPT előtt.

Ugyanaz a parodontológus vizsgálta és kezelte az összes beteget NSPT-vel, és gyűjtötte a GCF mintákat. GCF-t gyűjtöttek minden időpontban a szupragingivális plakk eltávolítása után kürettel, és a fogakat gyapotgolyókkal izolálták, hogy megakadályozzák a nyállal való szennyeződést. GCF mintákat gyűjtöttek szűrőpapír csíkokkal (PerioPaper, OraFlow Inc., Hewlett, New York, USA), amelyeket szubgingiválisan helyeztek el, amíg enyhe ellenállás nem érződött, 30 másodpercig. A csíkokat azonnal átvitték Eppendorf csövekbe, és -80 °C-on tárolták további elemzésig. A csíkokkal ellátott csöveket lemérték Mettler Toledo AT261 (DeltaRange®, Svájc olvashatóság: 0.01mg) segítségével mintavétel előtt és után a GCF térfogat meghatározásához, a térfogat = tömeg képlet alapján (egy µl egyenlő egy mg). A mély és sekély zsebekből származó mintákat külön Eppendorf csövekben tartották. Tris-HCL puffer (200 µl) 12mM végső koncentrációval (pH 7.6) került minden csőbe a fehérje eluálásához. Az egyes minták teljes fehérjekoncentrációját mérték NanoDrop Lite Plus Mikro-UV Spektrofotométerrel (Thermo Fisher Scientific, Wilmington, DE, USA) a gyártó utasításai szerint. Gyöngyalapú Immunvizsgálat Kereskedelmi forgalomban kapható gyöngyalapú immunvizsgálat Bio-Rad (katalógusszám # 171AK99MR2, BioRad, Hercules, CA, USA) segítségével 40 kemokin/citokin szintjét határozták meg pg/ml-ben. Ezen kívül a VEGF-C-t elemezték Milliplex panel segítségével (katalógusszám # HAGP1MAG-12K, Merck KGaA, Darmstadt, Németország). A gyártó protokolljait követték minden multiplex immunvizsgálati panelhez. Minden mérés előtt a rendszer kalibrálását és érvényesítését végeztük, hogy biztosítsuk a gyöngyolvasások pontosságát és megbízhatóságát. Az egyes analitok standard görbéjét ötparaméteres logisztikus regressziós görbékkel elemeztük Bio-Plex manager szoftverrel (verzió 6.0, BioRad). A kiugró értékeket a rendszer eltávolította.

Statisztikai elemzésMinden elemzést R v4.5.2-ben végeztük (28). Ábrákat készítettünk a ggplot2 csomaggal R-ben (29). Leíró statisztikákat, beleértve az átlagot, standard hibát (SE), mediánt és százalékokat, használtunk a vizsgálati résztvevők demográfiai jellemzőinek összefoglalására. Alapvonal (T0) összehasonlítások mély vs sekély zsebek között:A zsebmélység és a dohányzási állapot hatásainak értékeléséhez vegyes hatású modelleket illesztettünk az lmer() függvénnyel az lme4 csomagból R-ben (30) A fix hatások P-értékeit az lmerTest csomaggal kaptuk (31). Vegyes hatású megközelítést választottunk, hogy figyelembe vegyük az egyénen belüli páros mintavétel által bevezetett függőséget (egy sekély és egy mély parodontális zseb betegenként), egyéni véletlen metszetekkel véletlen hatásként. A modell tartalmazta a zsebmélységet (sekély vs mély), a dohányzási állapotot és interakciójukat prediktorokként; az interakciós tagot eltávolítottuk, amikor egyértelműen nem szignifikáns volt (P≥0.1). A minta méret korlátai miatt a nemet és a kort nem vettük fel kovariánsként az elsődleges modellekbe, bár potenciális hatásukat külön elemzésekben feltártuk. Longitudinális elemzés; ismételt kezelés hatásai A PPD, CAL, kemokin expresszió és GCF térfogat változásainak értékelésére a NSPT után mély zsebekben, három időpontban gyűjtött ismételt méréseket elemeztünk: alapvonal (T0), követés 1 (T1) és követés 2 (T2). Minden mérést ugyanarról a helyszínről kaptunk minden betegnél, így három megfigyelés jutott egyénenként. Ennek megfelelően ugyanazt a típusú vegyes hatású modelleket alkalmaztuk, mint fent, a zsebmélységet az ismételt NSPT-re cserélve rendezett kategorikus prediktorként (szintek: T0, T1, T2). A NSPT hatások alternatívájaként kiszámítottuk az egyének arányát, akik javulást mutattak T0-tól T2-ig minden gyulladásos marker esetében. Az egyéneket sikeresnek minősítettük, ha csökkenést mutattak a NSPT után. Minden marker esetében teszteltük a sikerek arányát binomiális teszttel, nullhipotézissel p=0.5 (azaz sikerek és kudarcok véletlenszerű eloszlása). Az elemzéseket külön végeztük dohányosok és nem dohányosok, valamint a kombinált minta esetében.A VEGF-C mérések eloszlási jellemzői miatt - konkrétan a nulla értékek magas aránya miatt - az adatokat két kategóriába osztottuk: nincs észlelés (0) és észlelés (1). Ezt a bináris eredményt általánosított lineáris vegyes hatású modellel (GLMM) elemeztük binomiális hibaeloszlással, amelyet a glmr() függvény implementált az lme4 csomagban R-hez. A dohányzási állapot, nem vagy kor hatását nem értékeltük a VEGF-C esetében.