Effetto del trattamento non chirurgico nei pazienti con parodontite concentrandosi sui mediatori infiammatori nel fluido crevicolare gengivale (NONSURG)

La parodontite è innescata da un microbiota disbiotico che colonizza la superficie del dente nella tasca parodontale, inducendo infiammazione cronica nei tessuti parodontali e portando successivamente alla distruzione e perdita dei tessuti di supporto del dente. La parodontite grave colpisce una parte sostanziale della popolazione mondiale e può portare alla perdita dei denti. Le risposte immunitarie dell'ospite nei tessuti parodontali sono responsabili della cascata di eventi che portano alla perdita ossea. Nel tessuto gengivale affetto da parodontite, le cellule immunitarie infiltranti e le cellule gengivali residenti producono citochine ed enzimi degradanti la matrice per eliminare i periodontopatogeni. Il fluido crevicolare gengivale (GCF) è un essudato sito-specifico che, nella gengiva infiammata, riflette il processo infiammatorio che vi avviene, e le citochine infiammatorie come IL-6, IFN-γ, IL-β nel GCF sono state correlate con la gravità della parodontite. Inoltre, il GCF è un fluido non invasivo e facilmente raccoglibile da analizzare. Le chemochine sono un sottogruppo specializzato di citochine che dirigono principalmente il movimento delle cellule immunitarie verso i siti di infiammazione tramite chemiotassi. Il reclutamento dei neutrofili è un processo altamente selettivo in cui l'espressione di specifici chemoattrattanti neutrofili, come CXCL1, CXCL2 e CXCL8, svolge un ruolo significativo nella patogenesi della parodontite. Inoltre, è riportato che i macrofagi presentano uno spettro di attivazione, che va da pro-infiammatorio ad anti-infiammatorio, nella malattia parodontale. Il fattore inibitorio della migrazione dei macrofagi (MIF) svolge un ruolo cruciale nel mantenere l'omeostasi dei macrofagi. È riportato avere funzioni diverse, con effetti sia protettivi che dannosi sul processo infiammatorio, metabolismo osseo, angiogenesi e apoptosi. Il fattore di crescita endoteliale vascolare-C (VEGF-C) è un importante membro della famiglia del fattore di crescita endoteliale vascolare, che accelera la crescita dei vasi sanguigni e linfatici. Inoltre, la crescita (linfangiogenesi) e il rimodellamento dei vasi linfatici in condizioni patologiche sono influenzati dalle chemochine e dai loro recettori espressi dalle cellule endoteliali linfatiche (LECs) all'interno e intorno al tessuto affetto. La linfangiogenesi è stata collegata all'infiammazione parodontale nei topi. Negli esseri umani, CCL21, un ligando importante per la migrazione delle cellule dendritiche, è down-regolato nei vasi linfatici di pazienti con parodontite. Il livello di VEGF-C è collegato a una prognosi sfavorevole nel cancro, e studi hanno riportato che l'espressione di MIF e VEGF-C sono fortemente correlate. Per quanto a nostra conoscenza, l'espressione di VEGF-C nel GCF umano non è mai stata indagata. Nei pazienti che ricevono terapia parodontale non chirurgica (NSPT), l'obiettivo del trattamento è controllare l'infiammazione e promuovere la guarigione del tessuto parodontale ristabilendo un microbiota normale. Nei fumatori, è stato precedentemente riportato una risposta di guarigione ostacolata dopo NSPT. Il fumo sembra modulare la composizione microbica e promuovere la colonizzazione di patogeni parodontali chiave. Evidenze emergenti suggeriscono che alcune citochine e chemochine nel GCF servono come promettenti biomarcatori per determinare la patogenesi, la prognosi della parodontite e la risposta alla NSPT. In questo studio, i ricercatori hanno analizzato l'espressione di chemochine/citochine e VEGF-C nel GCF di fumatori e non fumatori con parodontite grave all'interno di tasche profonde prima e durante la NSPT. Al basale, i ricercatori hanno anche confrontato i livelli di questi marcatori tra tasche parodontali superficiali e profonde in fumatori e non fumatori.

Materiali e metodi Popolazione dello studio: Gli individui indirizzati alla clinica specialistica presso il Centro di Competenza per la Salute Orale, Norvegia Occidentale per trattamento parodontale, sono stati invitati a partecipare al presente studio. I criteri di inclusione erano soggetti diagnosticati con parodontite di stadio III e IV secondo il sistema di classificazione EFP/AAP. Tutti i partecipanti idonei (n=30, età >16 anni) sono stati interrogati sulla loro storia di fumo e identificati come fumatori se fumatori negli ultimi 5 anni. I soggetti sono stati esclusi se riportavano uso di antibiotici negli ultimi 6 mesi, gravidanza, allattamento, terapia cronica con steroidi ad alte dosi, radioterapia o terapia immunosoppressiva. Non sono stati esclusi se riportavano diabete ben controllato. Il presente studio è stato approvato dal Comitato Regionale per l'Etica della Ricerca Medica in Norvegia Occidentale (REK), 2017/1650/REK Nord. Consensi informati sono stati ottenuti da tutti i pazienti prima dell'inclusione nello studio. Esame clinico dei siti inclusi nell'analisi La profondità di sondaggio della tasca (PPD), la perdita di attacco clinico (CAL) e il sanguinamento al sondaggio (BOP) sono stati misurati da quattro siti per dente eccetto i terzi molari, e la diagnosi è stata effettuata da un parodontologo alla prima visita di screening. Sono state raccolte informazioni riguardanti abitudini al fumo e diabete. Il campionamento del fluido crevicolare gengivale (GCF) è stato determinato dopo lo screening e comprendeva una tasca superficiale (≤4mm) e una profonda (≥5 mm) per ciascun paziente. Solo i denti con tasche profonde, stimati dal parodontologo persistere dopo i tre timepoint di trattamento, sono stati selezionati per il campionamento prima della NSPT al basale (T0). Il GCF è stato raccolto da tasche superficiali e profonde a T0, e da tasche profonde a T1 e T2 prima della NSPT.

Lo stesso parodontologo ha esaminato e trattato tutti i pazienti con NSPT e raccolto i campioni di GCF. Il GCF è stato raccolto ad ogni timepoint dopo la rimozione della placca sopragengivale con curette, e i denti sono stati isolati con rulli di cotone per prevenire la contaminazione con saliva. I campioni di GCF sono stati raccolti utilizzando strisce di carta filtro (PerioPaper, OraFlow Inc., Hewlett, New York, USA) inserite sottogengivalmente fino a lieve resistenza, per 30s. Le strisce sono state immediatamente trasferite in tubi Eppendorf e conservate a -80 °C fino ad ulteriore analisi. I tubi con strisce sono stati pesati utilizzando Mettler Toledo AT261 (DeltaRange®, Svizzera leggibilità: 0.01mg) prima e dopo il campionamento per ottenere il volume di GCF, utilizzando la formula volume uguale massa (un µl uguale a un mg). I campioni da tasche profonde e superficiali sono stati conservati in tubi Eppendorf separati. È stato aggiunto a ciascun tubo un buffer Tris-HCL (200 µl) con una concentrazione finale di 12mM (pH 7.6) per l'eluizione delle proteine. La concentrazione proteica totale per ciascun campione è stata misurata utilizzando lo spettrofotometro micro-UV NanoDrop Lite Plus (Thermo Fisher Scientific, Wilmington, DE, USA) seguendo le istruzioni del fornitore. Immunodosaggio basato su perle Utilizzando l'immunodosaggio basato su perle commercialmente disponibile Bio-Rad (numero di catalogo # 171AK99MR2, BioRad, Hercules, CA, USA), sono stati determinati i livelli di 40 chemochine/citochine in pg/ml. Inoltre, VEGF-C è stato analizzato utilizzando il pannello Milliplex (numero di catalogo # HAGP1MAG-12K, Merck KGaA, Darmstadt, Germania). Sono stati seguiti i protocolli del produttore per tutti i pannelli di immunoassay multiplex. Prima di ogni misurazione, sono state effettuate calibrazione e validazione del sistema per garantire accuratezza e affidabilità delle letture delle perle. La curva standard per ciascun analita è stata analizzata utilizzando curve di regressione logistica a cinque parametri utilizzando il software Bio-Plex manager (versione 6.0, BioRad). Gli outlier sono stati rimossi dal sistema.

Analisi statistica Tutte le analisi sono state condotte in R v4.5.2 (28). I grafici sono stati creati utilizzando il pacchetto ggplot2 in R (29). Statistiche descrittive inclusa media, errore standard (SE), mediana e percentuali, sono state utilizzate per riassumere le caratteristiche demografiche dei partecipanti allo studio. Confronti basali (T0) di tasche profonde vs superficiali: Per valutare gli effetti della profondità della tasca e dello stato di fumo, abbiamo adattato modelli ad effetti misti utilizzando la funzione lmer() dal pacchetto lme4 in R (30) I valori P per gli effetti fissi sono stati ottenuti con il pacchetto lmerTest (31). È stato scelto un approccio ad effetti misti per tenere conto della dipendenza introdotta dal campionamento appaiato all'interno degli individui (una tasca parodontale superficiale e una profonda per paziente), con intercette casuali individuali incluse come effetto casuale. Il modello includeva profondità della tasca (superficiale vs profonda), stato di fumo e la loro interazione come predittori; il termine di interazione è stato rimosso quando chiaramente non significativo (P≥0.1). A causa dei vincoli di dimensione del campione, sesso ed età non sono stati inclusi come covariate nei modelli primari, sebbene la loro potenziale influenza sia stata esplorata in analisi separate. Analisi longitudinale; effetti del trattamento ripetuto Per valutare i cambiamenti in PPD, CAL, espressione di chemochine e volume di GCF seguenti NSPT in tasche profonde, abbiamo analizzato le misurazioni ripetute raccolte a tre time point: basale (T0), follow-up 1 (T1) e follow-up 2 (T2). Ciascuna misurazione è stata ottenuta dallo stesso sito all'interno di ciascun paziente, fornendo tre osservazioni per individuo. Di conseguenza, abbiamo applicato lo stesso tipo di modelli ad effetti misti descritti sopra, sostituendo la profondità della tasca con la NSPT ripetuta come predittore categoriale ordinato (livelli: T0, T1, T2). Come alternativa agli effetti della NSPT, abbiamo calcolato la proporzione di individui che hanno mostrato miglioramento da T0 a T2 per ciascun marcatore infiammatorio. Gli individui sono stati classificati come di successo se hanno mostrato una riduzione dopo NSPT. Per ciascun marcatore, abbiamo testato la proporzione di successi utilizzando un test binomiale, assumendo un'ipotesi nulla di p=0.5 (cioè, una distribuzione casuale di successi e fallimenti). Le analisi sono state eseguite separatamente per fumatori e non fumatori, così come per il campione combinato. Date le caratteristiche distribuzionali delle misurazioni di VEGF-C - specificamente, l'alta proporzione di valori zero - i dati sono stati dicotomizzati in due categorie: nessuna rilevazione (0) e rilevazione (1). Questo esito binario è stato analizzato utilizzando un modello lineare generalizzato ad effetti misti (GLMM) con una distribuzione di errore binomiale, implementato tramite la funzione glmer() nel pacchetto lme4 per R. L'effetto dello stato di fumo, sesso o età non è stato valutato per VEGF-C.