Effekten av icke-kirurgisk behandling av patienter med parodontit med fokus på inflammatoriska medier i gingivalvätska (NONSURG)

Periodontit initieras av en dysbiotisk mikrobiota som koloniserar tandytan i den parodontala fickan, vilket inducerar kronisk inflammation i de parodontala vävnaderna och därefter leder till förstörelse och förlust av tandstödjande vävnader. Allvarlig periodontit drabbar en betydande del av den globala befolkningen och kan leda till tandförlust. Värdens immunresponser i de parodontala vävnaderna är ansvariga för händelsekedjan som leder till benförlust. I parodontit-drabbad gingivalvävnad producerar infiltrerande immunceller och residenta gingivala celler cytokiner och matrisnedbrytande enzymer för att eliminera periodontopatogener. Gingival crevicularvätska (GCF) är en plats-specifik exsudat som i inflammerad gingiva tjänar som en reflektion av den inflammatoriska processen som äger rum där, och inflammatoriska cytokiner som IL-6, IFN-γ, IL-β i GCF har visats korrelera med periodontitens svårighetsgrad. Dessutom är GCF en icke-invasiv och lätt insamlad vätska att analysera. Kemokiner är en specialiserad undergrupp av cytokiner som främst dirigerar rörelsen av immunceller till inflammationsplatser via kemotaxi. Neutrofilernas hemvist är en mycket selektiv process där uttrycket av specifika neutrofilkemoatraktanter, såsom CXCL1, CXCL2 och CXCL8, spelar en betydande roll i periodontitens patogenes. Dessutom rapporteras makrofager ha ett spektrum av aktivering, från proinflammatorisk till antiinflammatorisk, i parodontalsjukdom. Makrofagmigrationshämmande faktor (MIF) spelar en avgörande roll för att upprätthålla makrofaghomeostas. Den rapporteras ha olika funktioner, med både skyddande och skadliga effekter på inflammatorisk process, benmetabolism, angiogenes och apoptos. Vaskulär endotelial tillväxtfaktor-C (VEGF-C) är en viktig familjemedlem i familjen av vaskulära endoteliala tillväxtfaktorer, som accelererar tillväxten av blodkärl och lymfkärl. Vidare påverkas tillväxten (lymfangiogenes) och ommodelleringen av lymfkärl i patologiska tillstånd av kemokiner och deras receptorer som uttrycks av lymfatiska endotelceller (LEC) inom och runt den drabbade vävnaden. Lymfangiogenes har kopplats till parodontal inflammation hos möss. Hos människor är CCL21, en ligand viktig för dendritisk cellmigration, nere reglerad i lymfvägar från patienter med periodontit. VEGF-C-nivån är kopplad till dålig prognos vid cancer, och studier har rapporterat att uttrycket av MIF och VEGF-C är starkt korrelerade. Så vitt vi vet har VEGF-C-uttryck i mänsklig GCF aldrig undersökts. Hos patienter som får icke-kirurgisk parodontal terapi (NSPT) är målet med behandlingen att kontrollera inflammation och främja läkning av den parodontala vävnaden genom att återupprätta normal mikrobiota. Hos rökare rapporterades tidigare en hämmad läkningsrespons efter NSPT. Rökning verkar modulera mikrobiell sammansättning och främja kolonisering av nyckelperiodontopatogener. Ny evidens tyder på att vissa cytokiner och kemokiner i GCF fungerar som lovande biomarkörer för att fastställa patogenes, prognos för periodontit och respons på NSPT. I denna studie analyserade forskarna uttrycket av kemokiner/cytokiner och VEGF-C i GCF från rökare och icke-rökare med allvarlig periodontit inom djupa fickor före och under NSPT. Vid baslinje jämförde forskarna också nivåerna av dessa markörer mellan grunda och djupa parodontala fickor hos rökare och icke-rökare.

Material och metoder Studiebefolkning: Individer som remitterats till specialkliniken vid Oral Hälsa Expertiscentrum, Västra Norge för parodontal behandling, inbjöds att delta i denna studie. Inklusionskriterier var individer diagnostiserade med stadium III och IV periodontit enligt EFP/AAP-klassificeringssystemet. Alla berättigade deltagare (n=30, ålder >16 år) tillfrågades om deras rökhistorik och identifierades som rökare om de varit rökare de senaste 5 åren. Individer exkluderades om de rapporterade användning av antibiotika inom de senaste 6 månaderna, graviditet, amning, kronisk hög dos steroidterapi, strålning eller immunosuppressiv terapi. De exkluderades inte om de rapporterade välreglerad diabetes. Denna studie godkändes av Regionala kommittén för medicinsk forskningsetik i Väst Norge (REK), 2017/1650/REK Nord. Informerat samtycke erhölls från alla patienter före inkludering i studien.Klinisk undersökning av platser inkluderade i analysenSondering av fickdjup (PPD), klinisk fästeförlust (CAL) och blödning vid sondering (BOP) mättes från fyra platser per tand utom tredje molarer, och diagnos utfördes av en parodontolog vid det första screeningbesöket. Information om rökvanor och diabetes samlades in. Provtagning av gingival crevicularvätska (GCF) bestämdes efter screeningen och omfattade en grund (≤4mm) och en djup ficka (≥5 mm) för varje patient. Endast tänder med djupa fickor, som bedömdes av parodontologen att kvarstå efter de tre behandlingstidpunkterna, valdes för provtagning före NSPT vid baslinje (T0). GCF samlades in från grunda och djupa fickor vid T0, och från djupa fickor vid T1 och T2 före NSPT.

Samma parodontolog undersökte och behandlade alla patienter med NSPT och samlade in GCF-proverna. GCF samlades in vid varje tidpunkt efter supragingival plackborttagning med kurett, och tänder isolerades med bomullsrullar för att förhindra kontamination med saliv. GCF-prover samlades in med filterpappersremsor (PerioPaper, OraFlow Inc., Hewlett, New York, USA) som infördes subgingivt tills det fanns ett milt motstånd, i 30s. Remsor överfördes omedelbart till Eppendorf-rör och förvarades vid -80 °C tills vidare analys. Rören med remsor vägdes med Mettler Toledo AT261 (DeltaRange®, Schweiz läsbarhet: 0.01mg) före och efter provtagning för att erhålla GCF-volym, med formeln volym lika massa (en µl lika med en mg). Proverna från djupa och grunda fickor förvarades i separata Eppendorf-rör. Tris-HCL-buffert (200 µl) med en slutkoncentration 12mM (pH 7.6) tillsattes till varje rör för proteinelution. Total proteinkoncentration för varje prov mättes med NanoDrop Lite Plus Micro-UV Spectrophotometer (Thermo Fisher Scientific, Wilmington, DE, USA) enligt leverantörens instruktion. Pärlbaserad immunoassay Med kommersiellt tillgänglig pärlbaserad immunoassay Bio-Rad (katalognummer # 171AK99MR2, BioRad, Hercules, CA, USA), bestämdes nivåer av 40 kemokiner/cytokiner i pg/ml. Dessutom analyserades VEGF-C med Milliplex panel (katalognummer # HAGP1MAG-12K, Merck KGaA, Darmstadt, Tyskland). Tillverkarens protokoll följdes för alla multiplex immunoassay-paneler. Före varje mätning utfördes kalibrering och validering av systemet för att säkerställa noggrannhet och tillförlitlighet av pärl avläsningar. Standardkurvan för varje analyt analyserades med femparametrisk logistisk regressionskurva med Bio-Plex manager software (version 6.0, BioRad). Outliers togs bort av systemet.

Statistisk analysAlla analyser utfördes i R v4.5.2 (28). Diagram skapades med ggplot2-paketet i R (29). Beskrivande statistik inklusive medelvärde, standardfel (SE), median och procent användes för att sammanfatta de demografiska egenskaperna hos studiedeltagarna. Baslinje (T0) jämförelser av djupa vs grunda fickor:För att utvärdera effekterna av fickdjup och rökstatus, anpassade vi mixed-effects-modeller med lmer()-funktionen från lme4-paketet i R (30) P-värden för fasta effekter erhölls med lmerTest-paketet (31). En mixed effects-strategi valdes för att hantera beroende introducerat av parade provtagningar inom individer (en grund och en djup parodontal ficka per patient), med individuella slumpmässiga intercept inkluderade som den slumpmässiga effekten. Modellen inkluderade fickdjup (grund vs djup), rökstatus och deras interaktion som prediktorer; interaktionstermen togs bort när den var tydligt icke-signifikant (P≥0.1). På grund av urvalsstorleksbegränsningar inkluderades inte kön och ålder som kovariater i de primära modellerna, även om deras potentiella inflytande utforskades i separata analyser. Longitudinell analys; effekter av upprepad behandling För att utvärdera förändringar i PPD, CAL, kemokinexpression och GCF-volym efter NSPT i djupa fickor, analyserade vi upprepade mätningar insamlade vid tre tidpunkter: baslinje (T0), uppföljning 1 (T1) och uppföljning 2 (T2). Varje mätning erhölls från samma plats inom varje patient, vilket gav tre observationer per individ. Följaktligen tillämpade vi samma typ av mixed-effects-modeller som beskrivits ovan, och ersatte fickdjup med upprepad NSPT som en ordnad kategorisk prediktor (nivåer: T0, T1, T2). Som ett alternativ till NSPT-effekter beräknade vi andelen individer som visade förbättring från T0 till T2 för varje inflammatorisk markör. Individer klassificerades som framgångsrika om de uppvisade en minskning efter NSPT. För varje markör testade vi andelen framgångar med ett binomialtest, med en nollhypotes av p=0.5 (dvs. en slumpmässig fördelning av framgångar och misslyckanden). Analyser utfördes separat för rökare och icke-rökare, såväl som för det kombinerade urvalet.Givet fördelningskarakteristika för VEGF-C-mätningar - specifikt den höga andelen nollvärden - dikotomiserades data i två kategorier: ingen detektion (0) och detektion (1). Detta binära utfall analyserades med en generaliserad linjär mixed-effects-modell (GLMM) med en binomial felfördelning, implementerad via glmr()-funktionen i lme4-paketet för R. Effekten av rökstatus, kön eller ålder bedömdes inte för VEGF-C.