Effet du traitement non chirurgical des patients atteints de parodontite axé sur les médiateurs inflammatoires dans le fluide gingival (NONSURG)

La parodontite est initiée par un microbiote dysbiotique qui colonise la surface dentaire dans la poche parodontale, induisant une inflammation chronique dans les tissus parodontaux et conduisant ensuite à la destruction et à la perte des tissus de soutien dentaire. La parodontite sévère affecte une proportion substantielle de la population mondiale et peut mener à la perte dentaire. Les réponses immunitaires de l'hôte dans les tissus parodontaux sont responsables de la cascade d'événements qui conduit à la perte osseuse. Dans le tissu gingival affecté par la parodontite, les cellules immunitaires infiltrantes et les cellules gingivales résidentes produisent des cytokines et des enzymes dégradant la matrice pour éliminer les parodontopathogènes. Le fluide gingival creviculair (FGC) est un exsudat spécifique au site qui, dans la gencive enflammée, sert de reflet du processus inflammatoire qui s'y déroule, et les cytokines inflammatoires telles que l'IL-6, l'IFN-γ, l'IL-β dans le FGC, ont montré une corrélation avec la sévérité de la parodontite. De plus, le FGC est un fluide non invasif et facilement collecté pour l'analyse. Les chimiokines sont un sous-groupe spécialisé de cytokines qui dirigent principalement le mouvement des cellules immunitaires vers les sites d'inflammation via le chimiotactisme. Le recrutement des neutrophiles est un processus hautement sélectif dans lequel l'expression de chimiokines spécifiques pour les neutrophiles, telles que CXCL1, CXCL2 et CXCL8, joue un rôle significatif dans la pathogénèse de la parodontite. De plus, il est rapporté que les macrophages présentent un spectre d'activation, allant de pro-inflammatoire à anti-inflammatoire, dans la maladie parodontale. Le facteur inhibiteur de la migration des macrophages (MIF) joue un rôle crucial dans le maintien de l'homéostasie des macrophages. Il est rapporté avoir des fonctions diverses, avec des effets à la fois protecteurs et délétères sur le processus inflammatoire, le métabolisme osseux, l'angiogenèse et l'apoptose. Le facteur de croissance de l'endothélium vasculaire-C (VEGF-C) est un membre important de la famille des facteurs de croissance de l'endothélium vasculaire, accélérant la croissance des vaisseaux sanguins et lymphatiques. De plus, la croissance (lymphangiogenèse) et le remodelage des vaisseaux lymphatiques dans des conditions pathologiques sont influencés par les chimiokines et leurs récepteurs exprimés par les cellules endothéliales lymphatiques (CEL) dans et autour du tissu affecté. La lymphangiogenèse a été liée à l'inflammation parodontale chez la souris. Chez l'humain, CCL21, un ligand important pour la migration des cellules dendritiques, est régulé à la baisse dans les vaisseaux lymphatiques des patients atteints de parodontite. Le niveau de VEGF-C est lié à un mauvais pronostic dans le cancer, et des études ont rapporté que l'expression de MIF et VEGF-C sont fortement corrélées. À notre connaissance, l'expression de VEGF-C dans le FGC humain n'a jamais été étudiée. Chez les patients qui reçoivent un traitement parodontal non chirurgical (TPNC), l'objectif du traitement est de contrôler l'inflammation et de promouvoir la guérison du tissu parodontal en rétablissant un microbiote normal. Chez les fumeurs, une réponse de guérison entravée après TPNC a été rapportée précédemment. Le tabagisme semble moduler la composition microbienne et favoriser la colonisation de pathogènes parodontaux clés. Des preuves émergentes suggèrent que certaines cytokines et chimiokines dans le FGC servent de biomarqueurs prometteurs pour déterminer la pathogénèse, le pronostic de la parodontite et la réponse au TPNC. Dans cette étude, les investigateurs ont analysé l'expression des chimiokines/cytokines et de VEGF-C dans le FGC de fumeurs et non-fumeurs avec une parodontite sévère au sein de poches profondes avant et pendant le TPNC. Au départ, les investigateurs ont également comparé les niveaux de ces marqueurs entre les poches parodontales peu profondes et profondes chez les fumeurs et non-fumeurs.

Matériel et méthodes Population de l'étude : Les individus référés à la clinique spécialisée du Centre d'Expertise en Santé Bucco-dentaire, Norvège de l'Ouest pour un traitement parodontal, ont été invités à participer à la présente étude. Les critères d'inclusion étaient les sujets diagnostiqués avec une parodontite de stade III et IV selon le système de classification EFP/AAP. Tous les participants éligibles (n=30, âgés >16 ans) ont été interrogés sur leurs antécédents de tabagisme et ont été identifiés comme fumeurs s'ils fumaient depuis les 5 dernières années. Les sujets étaient exclus s'ils rapportaient l'utilisation d'antibiotiques dans les 6 derniers mois, une grossesse, l'allaitement, un traitement chronique à haute dose de stéroïdes, une radiothérapie ou un traitement immunosuppresseur. Ils n'étaient pas exclus s'ils rapportaient un diabète bien régulé. La présente étude a été approuvée par le Comité Régional d'Éthique de la Recherche Médicale en Norvège de l'Ouest (REK), 2017/1650/REK Nord. Les consentements éclairés ont été obtenus de tous les patients avant leur inclusion dans l'étude. Examen clinique des sites inclus dans l'analyse La profondeur de poche au sondage (PPS), la perte d'attache clinique (PAC) et le saignement au sondage (SAS) ont été mesurés sur quatre sites par dent sauf les troisièmes molaires, et le diagnostic a été effectué par un parodontiste lors de la première visite de dépistage. Les informations concernant les habitudes de tabagisme et le diabète ont été collectées. L'échantillonnage du fluide gingival creviculair (FGC) a été déterminé après le dépistage et comprenait une poche peu profonde (≤4mm) et une poche profonde (≥5 mm) pour chaque patient. Seules les dents avec des poches profondes, estimées par le parodontiste comme persistantes après les trois moments de traitement, ont été sélectionnées pour l'échantillonnage avant le TPNC au départ (T0). Le FGC a été collecté à partir des poches peu profondes et profondes à T0, et à partir des poches profondes à T1 et T2 avant le TPNC.

Le même parodontiste a examiné et traité tous les patients avec le TPNC et a collecté les échantillons de FGC. Le FGC a été collecté à chaque moment après l'élimination de la plaque sus-gingivale avec une curette, et les dents ont été isolées avec des rouleaux de coton pour éviter la contamination par la salive. Les échantillons de FGC ont été collectés en utilisant des bandelettes de papier filtre (PerioPaper, OraFlow Inc., Hewlett, New York, USA) insérées sous-gingivalement jusqu'à une légère résistance, pendant 30s. Les bandelettes ont été immédiatement transférées dans des tubes Eppendorf et stockées à -80 °C jusqu'à l'analyse ultérieure. Les tubes avec les bandelettes ont été pesés en utilisant Mettler Toledo AT261 (DeltaRange®, Suisse lisibilité : 0.01mg) avant et après l'échantillonnage pour obtenir le volume de FGC, en utilisant la formule volume égal masse (un µl égal à un mg). Les échantillons des poches profondes et peu profondes ont été conservés dans des tubes Eppendorf séparés. Un tampon Tris-HCL (200 µl) avec une concentration finale de 12mM (pH 7.6) a été ajouté à chaque tube pour l'élution des protéines. La concentration totale en protéines pour chaque échantillon a été mesurée en utilisant le spectrophotomètre micro-UV NanoDrop Lite Plus (Thermo Fisher Scientific, Wilmington, DE, USA) suivant les instructions du fournisseur. Immunodosage à base de billes En utilisant l'immunodosage à base de billes commercialement disponible Bio-Rad (numéro de catalogue # 171AK99MR2, BioRad, Hercules, CA, USA), les niveaux de 40 chimiokines/cytokines ont été déterminés en pg/ml. De plus, VEGF-C a été analysé en utilisant le panneau Milliplex (numéro de catalogue # HAGP1MAG-12K, Merck KGaA, Darmstadt, Allemagne). Les protocoles du fabricant ont été suivis pour tous les panneaux d'immunodosages multiplex. Avant chaque mesure, l'étalonnage et la validation du système ont été effectués pour assurer l'exactitude et la fiabilité des lectures des billes. La courbe standard pour chaque analyte a été analysée en utilisant des courbes de régression logistique à cinq paramètres avec le logiciel Bio-Plex manager (version 6.0, BioRad). Les valeurs aberrantes ont été supprimées par le système.

Analyse statistique Toutes les analyses ont été réalisées dans R v4.5.2 (28). Les graphiques ont été créés en utilisant le package ggplot2 dans R (29). Les statistiques descriptives incluant la moyenne, l'erreur standard (ES), la médiane et les pourcentages ont été utilisées pour résumer les caractéristiques démographiques des participants à l'étude. Comparaisons de base (T0) des poches profondes vs peu profondes : Pour évaluer les effets de la profondeur de poche et du statut tabagique, nous avons ajusté des modèles à effets mixtes en utilisant la fonction lmer() du package lme4 dans R (30) Les valeurs P pour les effets fixes ont été obtenues avec le package lmerTest (31). Une approche à effets mixtes a été choisie pour tenir compte de la dépendance introduite par l'échantillonnage apparié au sein des individus (une poche parodontale peu profonde et une profonde par patient), avec des intercepts aléatoires individuels inclus comme effet aléatoire. Le modèle incluait la profondeur de poche (peu profonde vs profonde), le statut tabagique et leur interaction comme prédicteurs ; le terme d'interaction a été retiré lorsqu'il était clairement non significatif (P≥0.1). En raison des contraintes de taille d'échantillon, le sexe et l'âge n'ont pas été inclus comme covariables dans les modèles primaires, bien que leur influence potentielle ait été explorée dans des analyses séparées. Analyse longitudinale ; effets du traitement répété Pour évaluer les changements dans PPS, PAC, l'expression des chimiokines et le volume de FGC suivant le TPNC dans les poches profondes, nous avons analysé les mesures répétées collectées à trois moments : départ (T0), suivi 1 (T1) et suivi 2 (T2). Chaque mesure a été obtenue du même site au sein de chaque patient, donnant trois observations par individu. En conséquence, nous avons appliqué le même type de modèles à effets mixtes décrits ci-dessus, en remplaçant la profondeur de poche par le TPNC répété comme prédicteur catégorique ordonné (niveaux : T0, T1, T2). Comme alternative aux effets du TPNC, nous avons calculé la proportion d'individus qui ont montré une amélioration de T0 à T2 pour chaque marqueur inflammatoire. Les individus ont été classés comme réussis s'ils présentaient une réduction après TPNC. Pour chaque marqueur, nous avons testé la proportion de réussites en utilisant un test binomial, en supposant une hypothèse nulle de p=0.5 (c'est-à-dire, une distribution aléatoire des réussites et échecs). Les analyses ont été réalisées séparément pour les fumeurs et les non-fumeurs, ainsi que pour l'échantillon combiné. Étant donné les caractéristiques de distribution des mesures de VEGF-C - spécifiquement, la forte proportion de valeurs zéro - les données ont été dichotomisées en deux catégories : non détection (0) et détection (1). Ce résultat binaire a été analysé en utilisant un modèle linéaire généralisé à effets mixtes (GLMM) avec une distribution d'erreur binomiale, implémenté via la fonction glmer() dans le package lme4 pour R. L'effet du statut tabagique, du sexe ou de l'âge n'a pas été évalué pour VEGF-C.