非手术治疗牙周炎患者对龈沟液炎症介质影响的研究 (NONSURG)

牙周炎是由定植于牙周袋内牙齿表面的菌群失调微生物群引发的，这些微生物群诱发牙周组织慢性炎症，进而导致牙齿支持组织的破坏和丧失。 重度牙周炎影响全球相当大比例的人口，并可能导致牙齿脱落。 牙周组织中宿主的免疫反应是导致骨丧失的一系列事件的原因。 在受牙周炎影响的牙龈组织中，浸润的免疫细胞和常驻牙龈细胞产生细胞因子和基质降解酶以清除牙周病原体。 龈沟液（GCF）是一种部位特异性渗出液，在发炎的牙龈中，它反映了该处发生的炎症过程，且GCF中的炎症细胞因子（如IL-6、IFN-γ、IL-β）已被证明与牙周炎严重程度相关。 此外，GCF是一种非侵入性且易于收集用于分析的液体。 趋化因子是细胞因子的一个专门亚群，主要通过趋化作用引导免疫细胞向炎症部位移动。 中性粒细胞的归巢是一个高度选择性的过程，其中特定中性粒细胞趋化因子（如CXCL1、CXCL2和CXCL8）的表达在牙周炎发病机制中起着重要作用。 此外，据报道，巨噬细胞在牙周病中具有从促炎到抗炎的激活谱。 巨噬细胞迁移抑制因子（MIF）在维持巨噬细胞稳态中起关键作用。 据报道，它具有多种功能，对炎症过程、骨代谢、血管生成和细胞凋亡既有保护作用，也有有害影响。 血管内皮生长因子-C（VEGF-C）是血管内皮生长因子家族的重要成员，可加速血管和淋巴管的生长。 此外，病理条件下淋巴管的生长（淋巴管生成）和重塑受受影响组织内部及周围淋巴管内皮细胞（LECs）表达的趋化因子及其受体的影响。 淋巴管生成已与小鼠的牙周炎症相关联。 在人类中，CCL21（一种对树突状细胞迁移重要的配体）在牙周炎患者的淋巴管中表达下调。 VEGF-C水平与癌症不良预后相关，且有研究报道MIF和VEGF-C的表达密切相关。 据我们所知，VEGF-C在人类GCF中的表达从未被研究过。 在接受非手术牙周治疗（NSPT）的患者中，治疗的目标是通过重建正常微生物群来控制炎症并促进牙周组织愈合。 在吸烟者中，先前有报道称NSPT后愈合反应受阻。 吸烟似乎会调节微生物组成并促进关键牙周病原体的定植。 新兴证据表明，GCF中的某些细胞因子和趋化因子可作为有前景的生物标志物，用于确定牙周炎的发病机制、预后以及对NSPT的反应。 在本研究中，研究者分析了吸烟者和非吸烟者在NSPT前和NSPT期间深牙周袋中GCF内趋化因子/细胞因子及VEGF-C的表达。 在基线时，研究者还比较了吸烟者和非吸烟者浅牙周袋和深牙周袋中这些标志物的水平。

材料与方法 研究人群：邀请转诊至西挪威口腔健康专家中心专科诊所进行牙周治疗的个人参与本研究。 纳入标准为根据EFP/AAP分类系统诊断为III期和IV期牙周炎的受试者。 所有符合条件的参与者（n=30，年龄>16岁）均被询问吸烟史，如果过去5年内吸烟则被识别为吸烟者。 如果受试者报告过去6个月内使用过抗生素、怀孕、哺乳、长期大剂量类固醇治疗、放射治疗或免疫抑制治疗，则被排除。 如果报告糖尿病控制良好，则不被排除。 本研究经西挪威地区医学研究伦理委员会（REK）批准，编号2017/1650/REK Nord。 所有患者在纳入研究前均签署知情同意书。 分析中包含位点的临床检查：除第三磨牙外，每颗牙的四个位点测量探诊深度（PPD）、临床附着丧失（CAL）和探诊出血（BOP），诊断由一位牙周病专家在首次筛查访视时进行。 收集了关于吸烟习惯和糖尿病的信息。 龈沟液（GCF）采样在筛查后确定，每位患者包括一个浅袋（≤4mm）和一个深袋（≥5mm）。 仅选择牙周病专家估计在治疗的三个时间点后仍会持续存在的深袋牙齿，在基线（T0）NSPT前进行采样。 在T0时从浅袋和深袋收集GCF，在T1和T2时在NSPT前从深袋收集GCF。

同一位牙周病专家检查并治疗所有患者的NSPT，并收集GCF样本。 在每个时间点，用刮治器去除龈上菌斑后收集GCF，并用棉卷隔离牙齿以防止唾液污染。 使用滤纸条（PerioPaper, OraFlow Inc., Hewlett, New York, USA）收集GCF样本，将其插入龈下直至遇到轻微阻力，持续30秒。 滤纸条立即转移至Eppendorf管中，并在-80°C储存直至进一步分析。 采样前后使用Mettler Toledo AT261（DeltaRange®, Switzerland 可读性：0.01mg）称重带有滤纸条的管子以获得GCF体积，使用公式体积等于质量（1μl等于1mg）。 深袋和浅袋的样本保存在单独的Eppendorf管中。 向每个管子中加入最终浓度为12mM（pH 7.6）的Tris-HCL缓冲液（200μl）进行蛋白洗脱。 使用NanoDrop Lite Plus Micro-UV分光光度计（Thermo Fisher Scientific, Wilgmington, DE, USA）按照供应商说明测量每个样品的总蛋白浓度。 基于微珠的免疫测定：使用市售的基于微珠的免疫测定Bio-Rad（目录号# 171AK99MR2, BioRad, Hercules, CA, USA），以pg/ml为单位测定40种趋化因子/细胞因子的水平。 此外，使用Milliplex panel（目录号# HAGP1MAG-12K, Merck KGaA, Darmstadt, Germany）分析VEGF-C。 所有多重免疫测定panel均遵循制造商的协议。 每次测量前，进行系统校准和验证以确保微珠读数的准确性和可靠性。 使用Bio-Plex manager软件（版本6.0, BioRad）通过五参数逻辑回归曲线分析每种分析物的标准曲线。 异常值由系统移除。

统计分析：所有分析均在R v4.5.2中进行（28）。 使用R中的ggplot2包创建图表（29）。 使用描述性统计（包括均值、标准误（SE）、中位数和百分比）总结研究参与者的人口统计学特征。 基线（T0）深袋与浅袋比较：为评估袋深和吸烟状态的影响，我们使用R中lme4包的lmer()函数拟合混合效应模型（30）。固定效应的P值使用lmerTest包获得（31）。 选择混合效应方法以考虑个体内配对抽样（每位患者一个浅袋和一个深牙周袋）引入的依赖性，并将个体随机截距作为随机效应纳入。 模型包括袋深（浅 vs 深）、吸烟状态及其交互作用作为预测因子；当交互项明显不显著时（P≥0.1）将其移除。 由于样本量限制，性别和年龄未作为协变量纳入主要模型，尽管在单独分析中探讨了它们的潜在影响。 纵向分析；重复治疗的效果：为评估深袋中NSPT后PPD、CAL、趋化因子表达和GCF体积的变化，我们分析了在三个时间点收集的重复测量数据：基线（T0）、随访1（T1）和随访2（T2）。 每次测量均来自每位患者的同一部位，每位个体产生三个观察值。 因此，我们应用上述相同类型的混合效应模型，将袋深替换为重复NSPT作为有序分类预测因子（水平：T0、T1、T2）。 作为NSPT效果的替代方案，我们计算了每种炎症标志物从T0到T2显示改善的个体比例。 如果个体在NSPT后表现出减少，则被分类为成功。 对于每种标志物，我们使用二项检验测试成功比例，假设零假设为p=0.5（即成功和失败的随机分布）。 分别对吸烟者和非吸烟者以及合并样本进行分析。 鉴于VEGF-C测量的分布特征——特别是零值的高比例——数据被二分为两类：未检测到（0）和检测到（1）。 使用广义线性混合效应模型（GLMM）分析此二元结果，该模型具有二项误差分布，通过R中lme4包的glmer()函数实现。 未评估吸烟状态、性别或年龄对VEGF-C的影响。