Wirkung der nicht-chirurgischen Behandlung von Parodontitis-Patienten mit Fokus auf Entzündungsmediatoren in der gingivalen Sulkusflüssigkeit (NONSURG)

Parodontitis wird durch eine dysbiotische Mikrobiota initiiert, die die Zahnfläche in der parodontalen Tasche besiedelt, eine chronische Entzündung in den parodontalen Geweben induziert und anschließend zur Zerstörung und zum Verlust der zahntragenden Gewebe führt. Schwere Parodontitis betrifft einen erheblichen Teil der Weltbevölkerung und kann zu Zahnverlust führen. Die Immunantworten des Wirts in den parodontalen Geweben sind für die Kaskade von Ereignissen verantwortlich, die zum Knochenverlust führen. In von Parodontitis betroffenem Zahnfleischgewebe produzieren infiltrierende Immunzellen und residente Zahnfleischzellen Zytokine und matrixabbauende Enzyme, um Parodontopathogene zu eliminieren. Die Zahnfleischsulkusflüssigkeit (GCF) ist ein standortspezifisches Exsudat, das bei entzündetem Zahnfleisch als Spiegelbild des dort stattfindenden Entzündungsprozesses dient, und Entzündungszytokine wie IL-6, IFN-γ, IL-β in GCF korrelieren nachweislich mit dem Schweregrad der Parodontitis. Darüber hinaus ist GCF eine nicht-invasive und leicht zu sammelnde Flüssigkeit zur Analyse. Chemokine sind eine spezialisierte Untergruppe von Zytokinen, die hauptsächlich die Bewegung von Immunzellen über Chemotaxis zu Entzündungsherden lenken. Das Homing von Neutrophilen ist ein hochselektiver Prozess, bei dem die Expression spezifischer Neutrophilen-Chemoattraktanten wie CXCL1, CXCL2 und CXCL8 eine bedeutende Rolle in der Pathogenese der Parodontitis spielt. Darüber hinaus wird berichtet, dass Makrophagen bei Parodontitis ein Spektrum an Aktivierung aufweisen, das von pro-inflammatorisch bis anti-inflammatorisch reicht. Der Makrophagen-Migrationsinhibitionsfaktor (MIF) spielt eine entscheidende Rolle bei der Aufrechterhaltung der Makrophagen-Homöostase. Ihm werden vielfältige Funktionen zugeschrieben, mit sowohl schützenden als auch schädlichen Auswirkungen auf den Entzündungsprozess, den Knochenstoffwechsel, die Angiogenese und die Apoptose. Vaskulärer endothelialer Wachstumsfaktor-C (VEGF-C) ist ein wichtiges Mitglied der Familie der vaskulären endothelialen Wachstumsfaktoren, das das Wachstum von Blut- und Lymphgefäßen beschleunigt. Darüber hinaus werden das Wachstum (Lymphangiogenese) und die Umgestaltung von Lymphgefäßen unter pathologischen Bedingungen durch Chemokine und ihre Rezeptoren beeinflusst, die von Lymphgefäß-Endothelzellen (LECs) innerhalb und um das betroffene Gewebe exprimiert werden. Lymphangiogenese wurde mit parodontaler Entzündung bei Mäusen in Verbindung gebracht. Beim Menschen ist CCL21, ein Ligand, der für die Migration dendritischer Zellen wichtig ist, in Lymphgefäßen von Patienten mit Parodontitis herunterreguliert. Der VEGF-C-Spiegel ist mit einer schlechten Prognose bei Krebs verbunden, und Studien berichten, dass die Expression von MIF und VEGF-C stark korreliert. Nach bestem Wissen wurde die VEGF-C-Expression in menschlicher GCF noch nie untersucht. Bei Patienten, die eine nicht-chirurgische Parodontaltherapie (NSPT) erhalten, zielt die Behandlung darauf ab, die Entzündung zu kontrollieren und die Heilung des parodontalen Gewebes durch Wiederherstellung der normalen Mikrobiota zu fördern. Bei Rauchern wurde zuvor eine beeinträchtigte Heilungsreaktion nach NSPT berichtet. Rauchen scheint die mikrobielle Zusammensetzung zu modulieren und die Besiedlung mit wichtigen Parodontopathogenen zu fördern. Neuere Erkenntnisse deuten darauf hin, dass bestimmte Zytokine und Chemokine in GCF vielversprechende Biomarker für die Bestimmung der Pathogenese, Prognose der Parodontitis und des Ansprechens auf NSPT darstellen. In dieser Studie analysierten die Forscher die Expression von Chemokinen/Zytokinen und VEGF-C in GCF von Rauchern und Nichtrauchern mit schwerer Parodontitis in tiefen Taschen vor und während der NSPT. Zum Ausgangszeitpunkt verglichen die Forscher auch die Spiegel dieser Marker zwischen flachen und tiefen parodontalen Taschen bei Rauchern und Nichtrauchern.

Material und Methoden Studienpopulation: Personen, die zur parodontalen Behandlung an die Fachklinik des Oral Health Centre of Expertise, Westnorwegen, überwiesen wurden, wurden eingeladen, an der vorliegenden Studie teilzunehmen. Einschlusskriterien waren Probanden, bei denen nach dem EFP/AAP-Klassifikationssystem eine Parodontitis im Stadium III und IV diagnostiziert wurde. Alle geeigneten Teilnehmer (n=30, Alter >16 Jahre) wurden nach ihrer Rauchergeschichte befragt und als Raucher identifiziert, wenn sie in den letzten 5 Jahren Raucher waren. Probanden wurden ausgeschlossen, wenn sie über die Einnahme von Antibiotika in den letzten 6 Monaten, Schwangerschaft, Stillzeit, chronische Hochdosis-Steroidtherapie, Strahlentherapie oder immunsuppressive Therapie berichteten. Sie wurden nicht ausgeschlossen, wenn sie über gut eingestellten Diabetes berichteten. Die vorliegende Studie wurde vom Regionalen Komitee für medizinische Forschungsethik in Westnorwegen (REK), 2017/1650/REK Nord, genehmigt. Vor der Aufnahme in die Studie wurden von allen Patienten informierte Einwilligungen eingeholt.Klinische Untersuchung der in die Analyse einbezogenen Stellen Sondierungstaschentiefe (PPD), klinischer Attachmentverlust (CAL) und Blutung auf Sondierung (BOP) wurden an vier Stellen pro Zahn außer dritten Molaren gemessen, und die Diagnose wurde von einem Parodontologen beim ersten Screening-Termin durchgeführt. Informationen über Rauchgewohnheiten und Diabetes wurden erhoben. Die Probenahme von Zahnfleischsulkusflüssigkeit (GCF) wurde nach dem Screening festgelegt und umfasste eine flache (≤4 mm) und eine tiefe Tasche (≥5 mm) für jeden Patienten. Nur Zähne mit tiefen Taschen, von denen der Parodontologe schätzte, dass sie nach den drei Behandlungspunkten bestehen bleiben würden, wurden vor der NSPT zum Ausgangszeitpunkt (T0) für die Probenahme ausgewählt. GCF wurde aus flachen und tiefen Taschen bei T0 und aus tiefen Taschen bei T1 und T2 vor der NSPT gesammelt.

Derselbe Parodontologe untersuchte und behandelte alle Patienten mit NSPT und sammelte die GCF-Proben. GCF wurde zu jedem Zeitpunkt nach Entfernung supragingivaler Plaque mit Küretten gesammelt, und die Zähne wurden mit Wattewalzen isoliert, um eine Kontamination mit Speichel zu verhindern. GCF-Proben wurden mit Filterpapierstreifen (PerioPaper, OraFlow Inc., Hewlett, New York, USA) gesammelt, die subgingival bis zu leichtem Widerstand für 30 s eingeführt wurden. Streifen wurden sofort in Eppendorf-Röhrchen überführt und bei -80 °C bis zur weiteren Analyse gelagert. Die Röhrchen mit Streifen wurden vor und nach der Probenahme mit Mettler Toledo AT261 (DeltaRange®, Schweiz Ablesbarkeit: 0,01 mg) gewogen, um das GCF-Volumen zu erhalten, unter Verwendung der Formel Volumen gleich Masse (ein µl gleich ein mg). Die Proben aus tiefen und flachen Taschen wurden in separaten Eppendorf-Röhrchen aufbewahrt. Tris-HCL-Puffer (200 µl) mit einer Endkonzentration von 12 mM (pH 7,6) wurde zu jedem Röhrchen für die Proteinelution hinzugefügt. Die Gesamtproteinkonzentration für jede Probe wurde mit dem NanoDrop Lite Plus Micro-UV-Spektrophotometer (Thermo Fisher Scientific, Wilmington, DE, USA) gemäß Anleitung des Herstellers gemessen. Perlenbasierter Immunoassay Unter Verwendung des kommerziell erhältlichen perlenbasierten Immunoassays Bio-Rad (Katalognummer # 171AK99MR2, BioRad, Hercules, CA, USA) wurden Spiegel von 40 Chemokinen/Zytokinen in pg/ml bestimmt. Zusätzlich wurde VEGF-C unter Verwendung des Milliplex-Panels (Katalognummer # HAGP1MAG-12K, Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland) analysiert. Die Protokolle des Herstellers wurden für alle Multiplex-Immunoassay-Panels befolgt. Vor jeder Messung wurden Kalibrierung und Validierung des Systems durchgeführt, um die Genauigkeit und Zuverlässigkeit der Perlenablesungen zu gewährleisten. Die Standardkurve für jeden Analyten wurde unter Verwendung von fünf parametrischen logistischen Regressionskurven mit der Bio-Plex-Manager-Software (Version 6.0, BioRad) analysiert. Ausreißer wurden vom System entfernt.

Statistische Analyse Alle Analysen wurden in R v4.5.2 (28) durchgeführt. Diagramme wurden mit dem ggplot2-Paket in R (29) erstellt. Deskriptive Statistiken, einschließlich Mittelwert, Standardfehler (SE), Median und Prozentsätze, wurden verwendet, um die demografischen Merkmale der Studien teilnehmer zusammenzufassen. Vergleiche von tiefen vs. flachen Taschen zum Ausgangszeitpunkt (T0): Um die Effekte von Taschentiefe und Raucherstatus zu bewerten, passten wir gemischte Effektmodelle unter Verwendung der lmer()-Funktion aus dem lme4-Paket in R (30) an. P-Werte für feste Effekte wurden mit dem lmerTest-Paket (31) erhalten. Ein gemischter Effektansatz wurde gewählt, um die Abhängigkeit zu berücksichtigen, die durch gepaarte Probenahme innerhalb von Individuen (eine flache und eine tiefe parodontale Tasche pro Patient) eingeführt wird, mit individuellen zufälligen Achsenabschnitten als zufälliger Effekt. Das Modell umfasste Taschentiefe (flach vs. tief), Raucherstatus und deren Interaktion als Prädiktoren; der Interaktionsterm wurde entfernt, wenn eindeutig nicht signifikant (P≥0,1). Aufgrund von Stichprobengrößenbeschränkungen wurden Geschlecht und Alter nicht als Kovariaten in den primären Modellen berücksichtigt, obwohl ihr potenzieller Einfluss in separaten Analysen untersucht wurde. Längsschnittanalyse; Effekte wiederholter Behandlung Um Veränderungen in PPD, CAL, Chemokinexpression und GCF-Volumen nach NSPT in tiefen Taschen zu bewerten, analysierten wir wiederholte Messungen, die an drei Zeitpunkten gesammelt wurden: Ausgangszeitpunkt (T0), Follow-up 1 (T1) und Follow-up 2 (T2). Jede Messung wurde von derselben Stelle innerhalb jedes Patienten erhalten, was drei Beobachtungen pro Individuum ergab. Dementsprechend wendeten wir denselben Typ von gemischten Effektmodellen an, wie oben beschrieben, und ersetzten die Taschentiefe durch wiederholte NSPT als geordneten kategorialen Prädiktor (Stufen: T0, T1, T2). Als Alternative zu NSPT-Effekten berechneten wir den Anteil der Individuen, die von T0 zu T2 eine Verbesserung für jeden Entzündungsmarker zeigten. Individuen wurden als erfolgreich klassifiziert, wenn sie nach NSPT eine Reduktion aufwiesen. Für jeden Marker testeten wir den Anteil der Erfolge unter Verwendung eines Binomialtests, unter Annahme einer Nullhypothese von p=0,5 (d.h. eine zufällige Verteilung von Erfolgen und Misserfolgen). Analysen wurden separat für Raucher und Nichtraucher sowie für die kombinierte Stichprobe durchgeführt. Angesichts der Verteilungseigenschaften von VEGF-C-Messungen – speziell des hohen Anteils an Nullwerten – wurden die Daten in zwei Kategorien dichotomisiert: keine Detektion (0) und Detektion (1). Dieses binäre Ergebnis wurde unter Verwendung eines generalisierten linearen gemischten Effektmodells (GLMM) mit einer Binomialfehlerverteilung analysiert, implementiert über die glmr()-Funktion im lme4-Paket für R. Der Effekt von Raucherstatus, Geschlecht oder Alter wurde für VEGF-C nicht bewertet.