Effekt av ikke-kirurgisk behandling av pasienter med perioditt med fokus på inflammatoriske mediatorer i gingivalspaltevæske (NONSURG)

Periodontitt initieres av en dysbiotisk mikrobiota som koloniserer tannoverflaten i den periodontale lommen, og induserer kronisk betennelse i periodontale vev, noe som etter hvert fører til ødeleggelse og tap av tannstøttevev. Alvorlig periodontitt rammer en betydelig andel av den globale befolkningen og kan føre til tanntap. Vertens immunresponser i de periodontale vevene er ansvarlige for hendelseskaskaden som fører til beintap. I gingivale vev som er påvirket av periodontitt, produserer infilttrerende immunceller og residerende gingivale celler cytokiner og matriksnedbrytende enzymer for å eliminere periodontopatogener. Gingival crevicular væske (GCF) er et stedsspesifikt eksudat som i betent gingiva tjener som et speilbilde av den inflammatoriske prosessen som finner sted der, og inflammatoriske cytokiner som IL-6, IFN-γ, IL-β i GCF, har vist seg å korrelere med periodontittens alvorlighetsgrad. I tillegg er GCF en ikke-invasiv og lett innsamlet væske å analysere. Kemokiner er en spesialisert undergruppe av cytokiner som primært styrer bevegelsen av immunceller til betennelsessteder via kemotaksi. Retningen av nøytrofiler er en høyst selektiv prosess der uttrykket av spesifikke nøytrofil kemotraktanter, som CXCL1, CXCL2 og CXCL8, spiller en betydelig rolle i periodontittens patogenese. Videre er det rapportert at makrofager har et spekter av aktivering, fra pro-inflammatorisk til anti-inflammatorisk, i periodontal sykdom. Makrofag migrasjonshemmende faktor (MIF) spiller en avgjørende rolle i å opprettholde makrofag homeostase. Det er rapportert å ha ulike funksjoner, med både beskyttende og skadelige effekter på inflammatorisk prosess, beinmetabolisme, angiogenese og apoptose. Vaskulær endotel vekstfaktor-C (VEGF-C) er et viktig familiemedlem av vaskulær endotel vekstfaktor familien, som akselererer veksten av blod- og lymfekar. Videre er veksten (lymfangiogenese) og omdanningen av lymfekar i patologiske tilstander påvirket av kemokiner og deres reseptorer uttrykt av lymfatiske endotelceller (LECs) innenfor og rundt det berørte vevet. Lymfangiogenese har blitt knyttet til periodontal betennelse hos mus. Hos mennesker er CCL21, en ligand viktig for dendrittisk celle migrasjon, nedregulert i lymfekar fra pasienter med periodontitt. VEGF-C nivå er knyttet til dårlig prognose ved kreft, og studier har rapportert at uttrykket av MIF og VEGF-C er sterkt korrelert. Så vidt vi vet, har VEGF-C uttrykk i menneskelig GCF aldri blitt undersøkt. Hos pasienter som mottar ikke-kirurgisk periodontal behandling (NSPT), er målet med behandlingen å kontrollere betennelse og fremme helbredelse av det periodontale vevet ved å gjenopprette normal mikrobiota. Hos røykere ble det tidligere rapportert en hemmet helbredelsesrespons etter NSPT. Røyking synes å modulere mikrobiell sammensetning og fremme kolonisering av nøkkel periodontale patogener. Nyere bevis tyder på at visse cytokiner og kemokiner i GCF tjener som lovende biomarkører for å bestemme patogenese, prognose for periodontitt, og respons på NSPT. I denne studien analyserte forskerne uttrykket av kemokiner/cytokiner, og VEGF-C i GCF fra røykere og ikke-røykere med alvorlig periodontitt innenfor dype lommer før og under NSPT. Ved baseline sammenlignet forskerne også nivåene av disse markørene mellom grunne og dype periodontale lommer hos røykere og ikke-røykere.

Materiale og metoder Studiepopulasjon: Personer henvist til spesialistklinikken ved Oral Health Centre of Expertise, Vest-Norge for periodontal behandling, ble invitert til å delta i denne studien. Inklusjonskriterier var individer diagnostisert med stadium III og IV periodontitt i henhold til EFP/AAP klassifiseringssystemet. Alle kvalifiserte deltakere (n=30, alder >16 år) ble spurt om røykehistorikk og ble identifisert som røykere hvis de hadde røykt de siste 5 årene. Deltakere ble ekskludert hvis de rapporterte bruk av antibiotika innen de siste 6 månedene, graviditet, amming, kronisk høydos steroidterapi, stråling, eller immunsuppressiv terapi. De ble ikke ekskludert hvis de rapporterte velregulert diabetes. Denne studien ble godkjent av Regional Committee for Medical Research Ethics in West Norway (REK), 2017/1650/REK Nord. Informerte samtykker ble innhentet fra alle pasienter før inkludering i studien.Klinisk undersøkelse av steder inkludert i analysenSøkedybde (PPD), klinisk festetap (CAL), og blødning ved sondering (BOP) ble målt fra fire steder per tann bortsett fra visdomstenner, og diagnosen ble utført av en periodontist ved det første screeningsbesøket. Informasjon om røykevaner og diabetes ble samlet inn. Innsamling av gingival crevicular væske (GCF) ble bestemt etter screeningen og omfattet en grunn (≤4mm) og en dyp lomme (≥5 mm) for hver pasient. Kun tenner med dype lommer, estimert av periodontisten til å vedvare etter de tre behandlingstidspunktene, ble valgt for prøvetaking før NSPT ved baseline (T0). GCF ble samlet fra grunne og dype lommer ved T0, og fra dype lommer ved T1 og T2 før NSPT.

Den samme periodontisten undersøkte og behandlet alle pasienter med NSPT og samlet GCF-prøvene. GCF ble samlet ved hvert tidspunkt etter fjerning av supragingival plakk med kurett, og tennene ble isolert med bomullsruller for å forhindre forurensning med spytt. GCF-prøver ble samlet ved bruk av filterpapirstrimler (PerioPaper, OraFlow Inc., Hewlett, New York, USA) som ble satt subgingivt til det var mild motstand, i 30s. Strimlene ble umiddelbart overført til Eppendorf-rør og ble lagret ved -80 °C til videre analyse. Rørene med strimler ble veid ved bruk av Mettler Toledo AT261 (DeltaRange®, Sveits lesbarhet: 0.01mg) før og etter prøvetaking for å få GCF-volum, ved å bruke formelen volum lik masse (en µl lik en mg). Prøvene fra dype og grunne lommer ble oppbevart i separate Eppendorf-rør. Tris-HCL buffer (200 µl) med en endelig konsentrasjon 12mM (pH 7.6) ble tilsatt hvert rør for proteinelusjon. Total proteinkonsentrasjon for hver prøve ble målt ved bruk av NanoDrop Lite Plus Micro-UV Spectrophotometer (Thermo Fisher Scientific, Wilmington, DE, USA) i henhold til leverandørens instruksjoner. Kulebasert immunoassay Ved bruk av kommersielt tilgjengelig kulebasert immunoassay Bio-Rad (katalognummer # 171AK99MR2, BioRad, Hercules, CA, USA), ble nivåer av 40 kemokiner/cytokiner bestemt i pg/ml. I tillegg ble VEGF-C analysert ved bruk av Milliplex panel (katalognummer # HAGP1MAG-12K, Merck KGaA, Darmstadt, Tyskland). Produsentens protokoller ble fulgt for alle multiplex immunoassay paneler. Før hver måling ble kalibrering og validering av systemet utført for å sikre nøyaktighet og pålitelighet av kuleavlesningene. Standardkurven for hvert analytt ble analysert ved bruk av fem parametrisk logistisk regresjonskurver ved bruk av Bio-Plex manager software (versjon 6.0, BioRad). Outliers ble fjernet av systemet.

Statistisk analyseAlle analyser ble utført i R v4.5.2 (28). Plott ble laget ved bruk av ggplot2 pakken i R (29). Beskrivende statistikk inkludert gjennomsnitt, standardfeil (SE), median, og prosenter, ble brukt til å oppsummere de demografiske egenskapene til studiedeltakerne. Baseline (T0) sammenligninger av dype vs grunne lommer:For å evaluere effektene av lommedybde og røyke status, tilpasset vi blandede effektmodeller ved bruk av lmer() funksjonen fra lme4 pakken i R (30) P-verdier for faste effekter ble oppnådd med lmerTest pakken (31). En blandet effekt tilnærming ble valgt for å ta hensyn til avhengighet introdusert av parvis prøvetaking innen individer (en grunn og en dyp periodontal lomme per pasient), med individuelle tilfeldige skjæringspunkter inkludert som den tilfeldige effekten. Modellen inkluderte lommedybde (grunn vs dyp), røyke status, og deres interaksjon som prediktorer; interaksjonsleddet ble fjernet når det tydelig var ikke-signifikant (P≥0.1). På grunn av prøvestørrelsesbegrensninger ble kjønn og alder ikke inkludert som kovariater i de primære modellene, selv om deres potensielle innflytelse ble utforsket i separate analyser. Longitudinal analyse; effekter av gjentatt behandling For å evaluere endringer i PPD, CAL, kemokinuttrykk, og GCF-volum etter NSPT i dype lommer, analyserte vi gjentatte målinger samlet ved tre tidspunkter: baseline (T0), oppfølging 1 (T1), og oppfølging 2 (T2). Hver måling ble oppnådd fra samme sted innen hver pasient, noe som ga tre observasjoner per individ. Følgelig anvendte vi samme type blandede effektmodeller beskrevet ovenfor, og erstattet lommedybde med gjentatt NSPT som en ordnet kategorisk prediktor (nivåer: T0, T1, T2). Som et alternativ for NSPT-effekter, beregnet vi andelen individer som viste forbedring fra T0 til T2 for hver inflammatorisk markør. Individer ble klassifisert som vellykkede hvis de utviste en reduksjon etter NSPT. For hver markør testet vi andelen av suksesser ved bruk av en binomial test, forutsatt en nullhypotese av p=0.5 (dvs., en tilfeldig fordeling av suksesser og fiaskoer). Analyser ble utført separat for røykere og ikke-røykere, så vel som for det kombinerte utvalget.Gitt fordelingsegenskapene til VEGF-C målinger - spesifikt, den høye andelen nullverdier - ble dataene dikotomisert i to kategorier: ingen deteksjon (0) og deteksjon (1). Dette binære utfallet ble analysert ved bruk av en generalisert lineær blandet effektmodell (GLMM) med en binomial feilfordeling, implementert via glmr() funksjonen i lme4 pakken for R. Effekten av røyke status, kjønn, eller alder ble ikke vurdert for VEGF-C.