Effekten af ikke-kirurgisk behandling af patienter med parodontitis med fokus på inflammatoriske mediatorer i gingival crevice-væske (NONSURG)

Periodontitis initieres af en dysbiotisk mikrobiota, som koloniserer tandoverfladen i den parodontale lomme, hvilket inducerer kronisk inflammation i de parodontale væv og efterfølgende fører til ødelæggelse og tab af tandstøttevæv. Svær periodontitis rammer en betydelig del af den globale befolkning og kan føre til tab af tænder. Værtens immunresponser i de parodontale væv er ansvarlige for kaskaden af begivenheder, der fører til knogletab. I parodontitis-ramt gingivavæv producerer infiltrerende immunceller og residente gingivale celler cytokiner og matrix-nedbrydende enzymer for at eliminere periodontopatogener. Gingival crevicular væske (GCF) er et stedsspecifikt ekssudat, der i betændt gingiva tjener som et spejlbillede af den inflammatoriske proces, der finder sted der, og inflammatoriske cytokiner såsom IL-6, IFN-γ, IL-β i GCF er vist at korrelere med periodontitisens sværhedsgrad. Derudover er GCF en ikke-invasiv og nemt indsamlet væske at analysere. Kemokiner er en specialiseret undergruppe af cytokiner, der primært dirigerer bevægelsen af immunceller til betændelsessteder via kemotaksi. Homing af neutrofiler er en højselektiv proces, hvor udtrykket af specifikke neutrofil-tiltrekningsfaktorer, såsom CXCL1, CXCL2 og CXCL8, spiller en betydelig rolle i periodontitispatogenesen. Desuden er det rapporteret, at makrofager har et spektrum af aktivering, fra pro-inflammatorisk til anti-inflammatorisk, ved parodontalsygdom. Makrofag-migrationshæmmende faktor (MIF) spiller en afgørende rolle i opretholdelsen af makrofag-homeostase. Det rapporteres at have forskellige funktioner, med både beskyttende og skadelige effekter på inflammatorisk proces, knoglemetabolisme, angiogenese og apoptose. Vaskulær endotel vækstfaktor-C (VEGF-C) er et vigtigt familiemedlem af den vaskulære endotel vækstfaktor-familie, der accelererer væksten af blod- og lymfekar. Yderligere påvirkes væksten (lymfangiogenese) og omdannelsen af lymfekar under patologiske forhold af kemokiner og deres receptorer udtrykt af lymfatiske endotelceller (LECs) inden i og omkring det påvirkede væv. Lymfangiogenese er blevet knyttet til parodontal inflammation hos mus. Hos mennesker er CCL21, en ligand vigtig for dendritisk cellevandring, nedreguleret i lymfekar fra patienter med periodontitis. VEGF-C-niveau er knyttet til dårlig prognose ved kræft, og studier har rapporteret, at udtrykket af MIF og VEGF-C er stærkt korreleret. Så vidt vi ved, er VEGF-C-udtryk i menneskelig GCF aldrig blevet undersøgt. Hos patienter, der modtager ikke-kirurgisk parodontal behandling (NSPT), er målet med behandlingen at kontrollere inflammation og fremme heling af det parodontale væv ved at genetablere normal mikrobiota. Hos rygere blev en hæmmet helingsrespons efter NSPT rapporteret tidligere. Rygning synes at modulere mikrobiel sammensætning og fremme kolonisering af nøgle-parodontopatogener. Ny evidens tyder på, at visse cytokiner og kemokiner i GCF fungerer som lovende biomarkører for at bestemme patogenesen, prognosen for periodontitis og respons på NSPT. I dette studie analyserede forskere udtrykket af kemokiner/cytokiner og VEGF-C i GCF fra rygere og ikke-rygere med svær periodontitis i dybe lommer før og under NSPT. På baseline sammenlignede forskerne også niveauerne af disse markører mellem lavvandede og dybe parodontale lommer hos rygere og ikke-rygere.

Materialer og metoder Studiepopulation: Personer henvist til specialklinikken på Oral Health Centre of Expertise, Western Norway for parodontalbehandling blev inviteret til at deltage i nærværende studie. Inklusionskriterier var personer diagnosticeret med stadium III og IV periodontitis i henhold til EFP/AAP-klassifikationssystemet. Alle berettigede deltagere (n=30, alder >16 år) blev spurgt om deres rygehistorie og blev identificeret som rygere, hvis de havde været rygere i de sidste 5 år. Deltagere blev ekskluderet, hvis de rapporterede brug af antibiotika inden for de sidste 6 måneder, graviditet, amning, kronisk højdosis steroidbehandling, stråling eller immunsuppressiv behandling. De blev ikke ekskluderet, hvis de rapporterede velreguleret diabetes. Nærværende studie blev godkendt af Regional Committee for Medical Research Ethics in West Norway (REK), 2017/1650/REK Nord. Informerede samtykker blev indhentet fra alle patienter før inklusion i studiet. Klinisk undersøgelse af steder inkluderet i analysen Lommedybde (PPD), klinisk tilknytnings tab (CAL) og blødning ved sondering (BOP) blev målt fra fire steder pr. tand undtagen tredje molare, og diagnosen blev udført af en parodontolog ved det første screeningsbesøg. Information om rygevaner og diabetes blev indsamlet. Indsamling af gingival crevicular væske (GCF) blev bestemt efter screeningen og omfattede én lavvandet (≤4 mm) og én dyb lomme (≥5 mm) for hver patient. Kun tænder med dybe lommer, som parodontologen vurderede ville bestå efter de tre behandlingstidspunkter, blev udvalgt til indsamling før NSPT på baseline (T0). GCF blev indsamlet fra lavvandede og dybe lommer ved T0 og fra dybe lommer ved T1 og T2 før NSPT.

Den samme parodontolog undersøgte og behandlede alle patienter med NSPT og indsamlede GCF-prøverne. GCF blev indsamlet ved hvert tidspunkt efter supragingival plakfjernelse med curette, og tænder blev isoleret med bomuldsruller for at forhindre kontaminering med spyt. GCF-prøver blev indsamlet ved brug af filterpapirstrimler (PerioPaper, OraFlow Inc., Hewlett, New York, USA), som blev indsat subgingivt, indtil der var mild modstand, i 30 sekunder. Strimler blev straks overført til Eppendorf-rør og blev opbevaret ved -80 °C indtil yderligere analyse. Rørene med strimler blev vejet ved brug af Mettler Toledo AT261 (DeltaRange®, Schweiz læsevenlighed: 0,01 mg) før og efter indsamling for at opnå GCF-volumen ved at bruge formlen volumen lig masse (én µl lig med én mg). Prøverne fra dybe og lavvandede lommer blev opbevaret i separate Eppendorf-rør. Tris-HCL-buffer (200 µl) med en slutkoncentration på 12 mM (pH 7,6) blev tilsat hvert rør til proteinelution. Totalproteinkoncentrationen for hver prøve blev målt ved brug af NanoDrop Lite Plus Micro-UV Spectrophotometer (Thermo Fisher Scientific, Wilmington, DE, USA) efter leverandørens instruktioner. Perlebaseret immunoassay Ved brug af kommercielt tilgængeligt perlebaseret immunoassay Bio-Rad (katalog nummer # 171AK99MR2, BioRad, Hercules, CA, USA) blev niveauer af 40 kemokiner/cytokiner bestemt i pg/ml. Derudover blev VEGF-C analyseret ved brug af Milliplex-panel (katalog nummer # HAGP1MAG-12K, Merck KGaA, Darmstadt, Tyskland). Producentens protokoller blev fulgt for alle multiplex immunoassay-paneler. Før hver måling blev kalibrering og validering af systemet udført for at sikre nøjagtighed og pålidelighed af perleaflæsningerne. Standardkurven for hvert analyt blev analyseret ved brug af fem parametriske logistiske regressionskurver ved brug af Bio-Plex manager-software (version 6.0, BioRad). Outliers blev fjernet af systemet.

Statistisk analyse Alle analyser blev udført i R v4.5.2 (28). Plots blev oprettet ved brug af ggplot2-pakken i R (29). Beskrivende statistik inklusive gennemsnit, standardfejl (SE), median og procenter blev brugt til at opsummere de demografiske karakteristika af studiedeltagerne. Baseline (T0) sammenligninger af dybe vs. lavvandede lommer: For at evaluere effekterne af lommedybde og rygestatus tilpassede vi blandede effektmodeller ved brug af lmer()-funktionen fra lme4-pakken i R (30) P-værdier for faste effekter blev opnået med lmerTest-pakken (31). En blandet effekt-tilgang blev valgt for at tage højde for afhængighed introduceret af parret indsamling inden for individer (én lavvandet og én dyb parodontal lomme pr. patient), med individuelle tilfældige skæringer inkluderet som den tilfældige effekt. Modellen inkluderede lommedybde (lavvandet vs. dyb), rygestatus og deres interaktion som prædiktorer; interaktionstermen blev fjernet, når den tydeligt var ikke-signifikant (P≥0,1). På grund af prøvestørrelsesbegrænsninger blev køn og alder ikke inkluderet som kovariater i de primære modeller, selvom deres potentielle indflydelse blev udforsket i separate analyser. Longitudinal analyse; effekter af gentagen behandling For at evaluere ændringer i PPD, CAL, kemokin-udtryk og GCF-volumen efter NSPT i dybe lommer analyserede vi gentagne målinger indsamlet ved tre tidspunkter: baseline (T0), opfølgning 1 (T1) og opfølgning 2 (T2). Hver måling blev opnået fra det samme sted inden for hver patient, hvilket gav tre observationer pr. individ. Derfor anvendte vi samme type blandede effektmodeller beskrevet ovenfor, hvor lommedybde blev erstattet med gentagen NSPT som en ordnet kategorisk prædiktor (niveauer: T0, T1, T2). Som et alternativ til NSPT-effekter beregnede vi andelen af individer, der viste forbedring fra T0 til T2 for hver inflammatorisk markør. Individer blev klassificeret som succesfulde, hvis de udviste en reduktion efter NSPT. For hver markør testede vi andelen af succes ved brug af en binomial test, forudsat en nulhypotese på p=0,5 (dvs. en tilfældig fordeling af succes og fiasko). Analyser blev udført separat for rygere og ikke-rygere såvel som for det kombinerede udvalg. På grund af fordelingskarakteristika ved VEGF-C-målinger - specifikt den høje andel af nulværdier - blev data dikotomiseret i to kategorier: ingen detektion (0) og detektion (1). Dette binære udfald blev analyseret ved brug af en generaliseret lineær blandet effektmodel (GLMM) med en binomial fejlfordeling, implementeret via glmr()-funktionen i lme4-pakken for R. Effekten af rygestatus, køn eller alder blev ikke vurderet for VEGF-C.