Vliv nechirurgické léčby pacientů s parodontitidou se zaměřením na zánětlivé mediátory v gingivální tekutině (NONSURG)

Parodontitida je zahájena dysbiotickou mikrobiotou, která kolonizuje povrch zubu v parodontální kapse, vyvolává chronický zánět v parodontálních tkáních a následně vede k destrukci a ztrátě tkání podpírajících zub. Těžká parodontitida postihuje značný podíl světové populace a může vést ke ztrátě zubů. Imunitní reakce hostitele v parodontálních tkáních jsou zodpovědné za kaskádu událostí, které vedou ke ztrátě kosti. V postižené gingivální tkáni u parodontitidy infiltrující imunitní buňky a rezidentní gingivální buňky produkují cytokiny a enzymy degradující matrix k eliminaci parodontopatogenů. Gingivální sulkulární tekutina (GCF) je místně specifický exsudát, který v zanícené gingivě slouží jako odraz zánětlivého procesu, který tam probíhá, a bylo prokázáno, že zánětlivé cytokiny jako IL-6, IFN-γ, IL-β v GCF korelují se závažností parodontitidy. GCF je navíc neinvazivní a snadno sbíratelná tekutina k analýze. Chemokiny jsou specializovanou podskupinou cytokinů, které primárně řídí pohyb imunitních buněk do míst zánětu prostřednictvím chemotaxe. Návrat neutrofilů je vysoce selektivní proces, ve kterém exprese specifických neutrofilních chemoatraktantů, jako jsou CXCL1, CXCL2 a CXCL8, hraje významnou roli v patogenezi parodontitidy. Navíc je hlášeno, že makrofágy mají spektrum aktivace sahající od prozánětlivé po protizánětlivou v parodontálním onemocnění. Inhibiční faktor migrace makrofágů (MIF) hraje klíčovou roli v udržování homeostázy makrofágů. Je hlášeno, že má různé funkce s ochrannými i škodlivými účinky na zánětlivý proces, metabolismus kostí, angiogenezi a apoptózu. Cévní endoteliální růstový faktor-C (VEGF-C) je důležitý člen rodiny cévních endoteliálních růstových faktorů, který urychluje růst cévních a lymfatických cév. Růst (lymfangioneze) a remodelace lymfatických cév v patologických podmínkách jsou navíc ovlivněny chemokiny a jejich receptory exprimovanými lymfatickými endoteliálními buňkami (LECs) uvnitř a kolem postižené tkáně. Lymfangioneze byla spojena se zánětem parodontu u myší. U lidí je CCL21, ligand důležitý pro migraci dendritických buněk, downregulován v lymfatice u pacientů s parodontitidou. Hladina VEGF-C je spojena se špatnou prognózou u rakoviny a studie hlásily, že exprese MIF a VEGF-C jsou silně korelovány. Podle našich nejlepších znalostí exprese VEGF-C v lidské GCF nebyla nikdy zkoumána. U pacientů, kteří podstupují nechirurgickou parodontální terapii (NSPT), je cílem léčby kontrola zánětu a podpora hojení parodontální tkáně obnovením normální mikrobioty. U kuřáků byla dříve hlášena zhoršená hojivá odpověď po NSPT. Zdá se, že kouření moduluje mikrobiální složení a podporuje kolonizaci klíčových parodontálních patogenů. Nové důkazy naznačují, že určité cytokiny a chemokiny v GCF slouží jako slibné biomarkery pro určení patogeneze, prognózy parodontitidy a odpovědi na NSPT. V této studii výzkumníci analyzovali expresi chemokinů/cytokinů a VEGF-C v GCF u kuřáků a nekuřáků s těžkou parodontitidou v hlubokých kapsách před a během NSPT. Na výchozím bodě výzkumníci také porovnali hladiny těchto markerů mezi mělkými a hlubokými parodontálními kapsami u kuřáků a nekuřáků.

Materiál a metody Studijní populace: Jedinci odeslaní do specializované kliniky v Centru odbornosti pro orální zdraví, Západní Norsko, na parodontální léčbu byli pozváni k účasti na této studii. Kritéria pro zařazení byli subjekty diagnostikované s parodontitidou stadia III a IV podle klasifikačního systému EFP/AAP. Všichni způsobilí účastníci (n=30, věk >16 let) byli dotazováni na svou kuřáckou anamnézu a byli identifikováni jako kuřáci, pokud byli kuřáky posledních 5 let. Subjekty byly vyloučeny, pokud hlásily užívání antibiotik v posledních 6 měsících, těhotenství, kojení, chronickou vysokodávkovou steroidní terapii, radiační nebo imunosupresivní terapii. Nebyly vyloučeny, pokud hlásily dobře regulovaný diabetes. Tato studie byla schválena Regionálním výborem pro lékařský výzkum a etiku v Západním Norsku (REK), 2017/1650/REK Nord. Informované souhlas byly získány od všech pacientů před zařazením do studie.Klinické vyšetření míst zahrnutých do analýzyHloubka parodontální sondáže (PPD), ztráta klinického připojení (CAL) a krvácení při sondáži (BOP) byly měřeny ze čtyř míst na zub kromě třetích stoliček a diagnóza byla provedena jedním parodontologem při první screeningové návštěvě. Byly shromážděny informace týkající se kuřáckých návyků a diabetu. Odběr gingivální sulkulární tekutiny (GCF) byl určen po screeningu a zahrnoval jednu mělkou (≤4mm) a jednu hlubokou kapsu (≥5 mm) pro každého pacienta. Pouze zuby s hlubokými kapsami, které podle odhadu parodontologa přetrvají po třech časových bodech léčby, byly vybrány pro odběr před NSPT na výchozím bodě (T0). GCF byla odebrána z mělkých a hlubokých kapes v T0 a z hlubokých kapes v T1 a T2 před NSPT.

Stejný parodontolog vyšetřil a léčil všechny pacienty NSPT a odebral vzorky GCF. GCF byla odebrána v každém časovém bodě po odstranění supragingiválního plaku kyretou a zuby byly izolovány vatovými válečky, aby se zabránilo kontaminaci slinami. Vzorky GCF byly odebrány pomocí filtračních papírkových proužků (PerioPaper, OraFlow Inc., Hewlett, New York, USA), které byly vloženy subgingiválně až do jemného odporu po dobu 30s. Proužky byly okamžitě přeneseny do Eppendorfových zkumavek a skladovány při -80 °C do další analýzy. Zkumavky s proužky byly zváženy pomocí Mettler Toledo AT261 (DeltaRange®, Švýcarsko čitelnost: 0,01mg) před a po odběru, aby se získal objem GCF, pomocí vzorce objem rovná se hmotnost (jeden µl se rovná jednomu mg). Vzorky z hlubokých a mělkých kapes byly uchovávány v oddělených Eppendorfových zkumavkách. Tris-HCL pufr (200 µl) s konečnou koncentrací 12mM (pH 7,6) byl přidán do každé zkumavky pro eluci proteinů. Celková koncentrace proteinu pro každý vzorek byla měřena pomocí NanoDrop Lite Plus Micro-UV spektrofotometru (Thermo Fisher Scientific, Wilmington, DE, USA) podle pokynů dodavatele. Imunoanalýza založená na kuličkách Pomocí komerčně dostupné imunoanalýzy založené na kuličkách Bio-Rad (katalogové číslo # 171AK99MR2, BioRad, Hercules, CA, USA) byly stanoveny hladiny 40 chemokinů/cytokinů v pg/ml. Navíc byl VEGF-C analyzován pomocí panelu Milliplex (katalogové číslo # HAGP1MAG-12K, Merck KGaA, Darmstadt, Německo). Pro všechny panely multiplexních imunoanalýz byly dodrženy protokoly výrobce. Před každým měřením byla provedena kalibrace a validace systému, aby byla zajištěna přesnost a spolehlivost čtení kuliček. Standardní křivka pro každý analyt byla analyzována pomocí pěti parametrických logistických regresních křivek pomocí softwaru Bio-Plex manager (verze 6.0, BioRad). Odlehlé hodnoty byly odstraněny systémem.

Statistická analýzaVšechny analýzy byly provedeny v R v4.5.2 (28). Grafy byly vytvořeny pomocí balíčku ggplot2 v R (29). Deskriptivní statistiky včetně průměru, standardní chyby (SE), mediánu a procent byly použity k shrnutí demografických charakteristik účastníků studie. Porovnání hlubokých vs mělkých kapes na výchozím bodě (T0):Pro vyhodnocení účinků hloubky kapsy a kuřáckého stavu jsme použili modely smíšených efektů pomocí funkce lmer() z balíčku lme4 v R (30). P-hodnoty pro fixní efekty byly získány pomocí balíčku lmerTest (31). Přístup smíšených efektů byl zvolen, aby se zohlednila závislost zavedená párovým odběrem uvnitř jednotlivců (jedna mělká a jedna hluboká parodontální kapsa na pacienta), s individuálními náhodnými intercepty zahrnutými jako náhodný efekt. Model zahrnoval hloubku kapsy (mělká vs hluboká), kuřácký stav a jejich interakci jako prediktory; interakční člen byl odstraněn, když byl jasně nevýznamný (P≥0,1). Kvůli omezením velikosti vzorku pohlaví a věk nebyly zahrnuty jako kovariáty v primárních modelech, ačkoli jejich potenciální vliv byl prozkoumán v samostatných analýzách. Longitudinální analýza; účinky opakované léčby Pro vyhodnocení změn v PPD, CAL, expresi chemokinů a objemu GCF po NSPT v hlubokých kapsách jsme analyzovali opakovaná měření shromážděná ve třech časových bodech: výchozí bod (T0), sledování 1 (T1) a sledování 2 (T2). Každé měření bylo získané ze stejného místa u každého pacienta, což poskytlo tři pozorování na jednotlivce. V souladu s tím jsme použili stejný typ modelů smíšených efektů popsaných výše, nahrazujíc hloubku kapsy opakovanou NSPT jako uspořádaný kategorický prediktor (úrovně: T0, T1, T2). Jako alternativu účinků NSPT jsme vypočítali podíl jednotlivců, kteří vykazovali zlepšení z T0 na T2 pro každý zánětlivý marker. Jednotlivci byli klasifikováni jako úspěšní, pokud vykazovali redukci po NSPT. Pro každý marker jsme testovali podíl úspěchů pomocí binomického testu, za předpokladu nulové hypotézy p=0,5 (tj. náhodného rozdělení úspěchů a neúspěchů). Analýzy byly provedeny odděleně pro kuřáky a nekuřáky, stejně jako pro kombinovaný vzorek.Vzhledem k distribučním charakteristikám měření VEGF-C - konkrétně vysokému podílu nulových hodnot - byla data dichotomizována do dvou kategorií: žádná detekce (0) a detekce (1). Tento binární výsledek byl analyzován pomocí zobecněného lineárního modelu smíšených efektů (GLMM) s binomickým rozdělením chyb, implementovaného pomocí funkce glmr() v balíčku lme4 pro R. Účinek kuřáckého stavu, pohlaví nebo věku nebyl pro VEGF-C hodnocen.