Влияние нехирургического лечения пациентов с пародонтитом на медиаторы воспаления в десневой жидкости (NONSURG)

Периодонтит инициируется дисбиотической микробиотой, которая колонизирует поверхность зуба в пародонтальном кармане, вызывая хроническое воспаление в тканях пародонта и впоследствии приводя к разрушению и потере тканей, поддерживающих зуб. Тяжелый периодонтит затрагивает значительную часть населения мира и может привести к потере зубов. Иммунные реакции организма в тканях пародонта ответственны за каскад событий, ведущих к потере костной ткани. В пораженной периодонтитом десневой ткани инфильтрирующие иммунные клетки и резидентные клетки десны вырабатывают цитокины и матрикс-разрушающие ферменты для устранения периодонтопатогенов. Десневая жидкость (ДЖ) — это специфичный для участка экссудат, который в воспаленной десне служит отражением воспалительного процесса, происходящего там, и было показано, что воспалительные цитокины, такие как IL-6, IFN-γ, IL-β в ДЖ, коррелируют с тяжестью периодонтита. Кроме того, ДЖ — это неинвазивная и легко собираемая жидкость для анализа. Хемокины — это специализированная подгруппа цитокинов, которые в основном направляют движение иммунных клеток к местам воспаления посредством хемотаксиса. Хоминг нейтрофилов — это высокоизбирательный процесс, в котором экспрессия специфических хемоаттрактантов нейтрофилов, таких как CXCL1, CXCL2 и CXCL8, играет значительную роль в патогенезе периодонтита. Кроме того, сообщается, что макрофаги имеют спектр активации, от провоспалительного до противовоспалительного, при пародонтальном заболевании. Фактор ингибирования миграции макрофагов (MIF) играет решающую роль в поддержании гомеостаза макрофагов. Сообщается, что он обладает разнообразными функциями, как защитными, так и вредными, в отношении воспалительного процесса, метаболизма костной ткани, ангиогенеза и апоптоза. Фактор роста эндотелия сосудов-C (VEGF-C) — важный член семейства факторов роста эндотелия сосудов, ускоряющий рост кровеносных и лимфатических сосудов. Кроме того, рост (лимфангиогенез) и ремоделирование лимфатических сосудов в патологических условиях находятся под влиянием хемокинов и их рецепторов, экспрессируемых лимфатическими эндотелиальными клетками (ЛЭК) внутри и вокруг пораженной ткани. Лимфангиогенез был связан с пародонтальным воспалением у мышей. У людей CCL21, лиганд, важный для миграции дендритных клеток, подавлен в лимфатических сосудах у пациентов с периодонтитом. Уровень VEGF-C связан с плохим прогнозом при раке, и исследования сообщают, что экспрессия MIF и VEGF-C сильно коррелирует. Насколько нам известно, экспрессия VEGF-C в ДЖ человека никогда не исследовалась. У пациентов, получающих нехирургическую пародонтальную терапию (НХПТ), цель лечения — контролировать воспаление и способствовать заживлению пародонтальной ткани путем восстановления нормальной микробиоты. У курильщиков ранее сообщалось о затрудненной реакции заживления после НХПТ. Курение, по-видимому, модулирует микробный состав и способствует колонизации ключевых пародонтальных патогенов. Появляющиеся данные свидетельствуют о том, что определенные цитокины и хемокины в ДЖ служат многообещающими биомаркерами для определения патогенеза, прогноза периодонтита и реакции на НХПТ. В этом исследовании исследователи проанализировали экспрессию хемокинов/цитокинов и VEGF-C в ДЖ у курильщиков и некурящих с тяжелым периодонтитом в глубоких карманах до и во время НХПТ. На исходном уровне исследователи также сравнили уровни этих маркеров между мелкими и глубокими пародонтальными карманами у курильщиков и некурящих.

Материалы и методы Исследуемая популяция: Лица, направленные в специализированную клинику Центра экспертизы здоровья полости рта Западной Норвегии для пародонтального лечения, были приглашены принять участие в настоящем исследовании. Критериями включения были субъекты с диагнозом периодонтита III и IV стадии согласно классификационной системе EFP/AAP. Все подходящие участники (n=30, возраст >16 лет) были опрошены об их истории курения и идентифицированы как курильщики, если они курили в течение последних 5 лет. Субъекты исключались, если они сообщали об использовании антибиотиков в течение последних 6 месяцев, беременности, лактации, хронической терапии высокими дозами стероидов, лучевой или иммуносупрессивной терапии. Они не исключались, если сообщали о хорошо контролируемом диабете. Настоящее исследование было одобрено Региональным комитетом по медицинской этике исследований в Западной Норвегии (REK), 2017/1650/REK Nord. Информированное согласие было получено от всех пациентов до включения в исследование.Клиническое обследование участков, включенных в анализГлубина зондирования кармана (PPD), потеря клинического прикрепления (CAL) и кровоточивость при зондировании (BOP) измерялись с четырех участков на каждый зуб, кроме третьих моляров, и диагноз был поставлен одним пародонтологом при первом скрининговом визите. Была собрана информация о привычках курения и диабете. Отбор образцов десневой жидкости (ДЖ) определялся после скрининга и включал один мелкий (≤4 мм) и один глубокий карман (≥5 мм) для каждого пациента. Только зубы с глубокими карманами, по оценке пародонтолога, сохраняющимися после трех временных точек лечения, были отобраны для взятия проб до НХПТ на исходном уровне (T0). ДЖ собирали из мелких и глубоких карманов на T0 и из глубоких карманов на T1 и T2 до НХПТ.

Один и тот же пародонтолог обследовал и лечил всех пациентов с помощью НХПТ и собирал образцы ДЖ. ДЖ собирали в каждой временной точке после удаления наддесневого налета кюреткой, а зубы изолировали ватными валиками для предотвращения загрязнения слюной. Образцы ДЖ собирали с использованием бумажных полосок (PerioPaper, OraFlow Inc., Хьюлетт, Нью-Йорк, США), которые вводили поддеснево до легкого сопротивления на 30 с. Полоски немедленно переносили в пробирки Эппендорфа и хранили при -80 °C до дальнейшего анализа. Пробирки с полосками взвешивали с помощью Mettler Toledo AT261 (DeltaRange®, Швейцария, считываемость: 0,01 мг) до и после отбора проб для получения объема ДЖ, используя формулу объем равен массе (один мкл равен одному мг). Образцы из глубоких и мелких карманов хранили в отдельных пробирках Эппендорфа. В каждую пробирку добавляли Tris-HCL буфер (200 мкл) с конечной концентрацией 12 мМ (pH 7,6) для элюции белка. Общую концентрацию белка для каждого образца измеряли с использованием микро-УФ спектрофотометра NanoDrop Lite Plus (Thermo Fisher Scientific, Уилмингтон, Делавэр, США) в соответствии с инструкциями поставщика. Иммуноанализ на основе шариков С использованием коммерчески доступного иммуноанализа на основе шариков Bio-Rad (каталожный номер # 171AK99MR2, BioRad, Геркулес, Калифорния, США) уровни 40 хемокинов/цитокинов определяли в пг/мл. Кроме того, VEGF-C анализировали с использованием панели Milliplex (каталожный номер # HAGP1MAG-12K, Merck KGaA, Дармштадт, Германия). Для всех панелей мультиплексных иммуноанализов следовали протоколам производителя. Перед каждым измерением проводили калибровку и валидацию системы для обеспечения точности и надежности показаний шариков. Калибровочную кривую для каждого аналита анализировали с использованием пятипараметрических логистических регрессионных кривых с использованием программного обеспечения Bio-Plex manager (версия 6.0, BioRad). Выбросы удалялись системой.

Статистический анализВсе анализы проводились в R v4.5.2 (28). Графики создавались с использованием пакета ggplot2 в R (29). Описательная статистика, включая среднее значение, стандартную ошибку (SE), медиану и проценты, использовалась для обобщения демографических характеристик участников исследования. Сравнение глубоких и мелких карманов на исходном уровне (T0):Для оценки влияния глубины кармана и статуса курения мы подгоняли модели со смешанными эффектами с использованием функции lmer() из пакета lme4 в R (30). P-значения для фиксированных эффектов получали с помощью пакета lmerTest (31). Был выбран подход со смешанными эффектами, чтобы учесть зависимость, введенную парным отбором проб внутри индивидов (один мелкий и один глубокий пародонтальный карман на пациента), с индивидуальными случайными пересечениями, включенными как случайный эффект. Модель включала глубину кармана (мелкий vs глубокий), статус курения и их взаимодействие в качестве предикторов; член взаимодействия удалялся, когда он явно не был значимым (P≥0,1). Из-за ограничений размера выборки пол и возраст не включались в качестве ковариат в основные модели, хотя их потенциальное влияние исследовалось в отдельных анализах. Лонгитюдный анализ; эффекты повторного лечения Для оценки изменений PPD, CAL, экспрессии хемокинов и объема ДЖ после НХПТ в глубоких карманах мы анализировали повторные измерения, собранные в трех временных точках: исходный уровень (T0), последующее наблюдение 1 (T1) и последующее наблюдение 2 (T2). Каждое измерение было получено с одного и того же участка у каждого пациента, давая три наблюдения на индивида. Соответственно, мы применяли тот же тип моделей со смешанными эффектами, описанных выше, заменяя глубину кармана на повторную НХПТ как упорядоченный категориальный предиктор (уровни: T0, T1, T2). В качестве альтернативы эффектам НХПТ мы рассчитывали долю индивидов, которые показали улучшение от T0 до T2 для каждого воспалительного маркера. Индивиды классифицировались как успешные, если они демонстрировали снижение после НХПТ. Для каждого маркера мы тестировали долю успехов с использованием биномиального теста, предполагая нулевую гипотезу p=0,5 (т.е. случайное распределение успехов и неудач). Анализы проводились отдельно для курильщиков и некурящих, а также для объединенной выборки.Учитывая распределительные характеристики измерений VEGF-C — в частности, высокую долю нулевых значений — данные были дихотомизированы на две категории: не обнаружено (0) и обнаружено (1). Этот бинарный исход анализировали с использованием обобщенной линейной модели со смешанными эффектами (GLMM) с биномиальным распределением ошибок, реализованной через функцию glmr() в пакете lme4 для R. Влияние статуса курения, пола или возраста на VEGF-C не оценивалось.