치은열구액 내 염증 매개체에 초점을 맞춘 치주염 환자의 비외과적 치료 효과 (NONSURG)

치주염은 치주낭 내 치아 표면에 정착하는 균총 이상으로 시작되어, 치주 조직에서 만성 염증을 유발하고 이어서 치아 지지 조직의 파괴와 소실로 이어집니다. 심한 치주염은 전 세계 인구의 상당 부분에 영향을 미치며 치아 상실을 초래할 수 있습니다. 치주 조직 내 숙주의 면역 반응은 골 소실로 이어지는 일련의 사건들을 담당합니다. 치주염에 영향을 받은 치은 조직에서는 침투하는 면역 세포와 거주 치은 세포가 치주 병원균을 제거하기 위해 사이토카인과 기질 분해 효소를 생산합니다. 치은열구액(GCF)은 염증이 있는 치은에서 해당 부위에서 일어나는 염증 과정을 반영하는 부위 특이적 삼출물이며, GCF 내 IL-6, IFN-γ, IL-β와 같은 염증성 사이토카인은 치주염의 중증도와 상관관계가 있는 것으로 나타났습니다. 또한 GCF는 비침습적이고 쉽게 수집하여 분석할 수 있는 체액입니다. 케모카인은 주로 화성작용을 통해 면역 세포의 염증 부위로의 이동을 지시하는 사이토카인의 특화된 하위 그룹입니다. 호중구의 귀환은 CXCL1, CXCL2, CXCL8와 같은 특정 호중구 화학유인 물질의 발현이 치주염 발병 기전에서 중요한 역할을 하는 매우 선택적인 과정입니다. 더욱이, 대식세포는 치주 질환에서 염증 촉진성에서 항염증성에 이르는 활성화 스펙트럼을 가진 것으로 보고됩니다. 대식세포 이동 억제 인자(MIF)는 대식세포 항상성 유지에 중요한 역할을 합니다. 이는 염증 과정, 골 대사, 혈관 신생, 세포 사멸에 대한 보호 효과와 해로운 효과를 모두 가지는 다양한 기능을 가진 것으로 보고됩니다. 혈관 내피 성장 인자-C(VEGF-C)는 혈관 및 림프관의 성장을 촉진하는 혈관 내피 성장 인자 패밀리의 중요한 구성원입니다. 또한, 병리적 상태에서 림프관의 성장(림프관 신생)과 재형성은 영향을 받은 조직 내부 및 주변의 림프관 내피 세포(LEC)에 의해 발현되는 케모카인과 그 수용체의 영향을 받습니다. 림프관 신생은 쥐에서 치주 염증과 연관되어 있습니다. 인간에서는 수지상 세포 이동에 중요한 리간드인 CCL21이 치주염 환자의 림프관에서 발현이 감소합니다. VEGF-C 수준은 암의 불량한 예후와 연관되어 있으며, 연구에 따르면 MIF와 VEGF-C의 발현은 강한 상관관계를 보입니다. 우리가 아는 한, 인간 GCF에서의 VEGF-C 발현은 조사된 적이 없습니다. 비외과적 치주 치료(NSPT)를 받는 환자에서 치료의 목표는 정상적인 균총을 재확립함으로써 염증을 통제하고 치주 조직의 치유를 촉진하는 것입니다. 흡연자에서는 NSPT 후 저하된 치유 반응이 이전에 보고되었습니다. 흡연은 미생물 조성을 변조하고 주요 치주 병원균의 정착을 촉진하는 것으로 보입니다. 새로운 증거는 GCF 내 특정 사이토카인과 케모카인이 치주염의 발병 기전, 예후 및 NSPT에 대한 반응을 결정하는 유망한 바이오마커 역할을 할 수 있음을 시사합니다. 이 연구에서 연구자들은 심한 치주염을 가진 흡연자와 비흡연자의 깊은 치주낭에서 NSPT 전과 치료 중에 GCF 내 케모카인/사이토카인 및 VEGF-C의 발현을 분석했습니다. 기준선에서 연구자들은 또한 흡연자와 비흡연자에서 얕은 치주낭과 깊은 치주낭 사이의 이러한 마커 수준을 비교했습니다.

재료 및 방법 연구 대상: 서부 노르웨이 구강 건강 전문 센터의 전문 클리닉에 치주 치료를 위해 의뢰된 개인들이 본 연구에 참여하도록 초대되었습니다. 포함 기준은 EFP/AAP 분류 시스템에 따라 3기 및 4기 치주염으로 진단된 대상자였습니다. 모든 적격 참가자(n=30, 연령 >16세)는 흡연력에 대해 질문을 받았으며, 지난 5년 동안 흡연자인 경우 흡연자로 확인되었습니다. 대상자는 지난 6개월 이내 항생제 사용, 임신, 수유, 만성 고용량 스테로이드 요법, 방사선 치료 또는 면역억제 치료를 보고한 경우 제외되었습니다. 잘 조절된 당뇨병을 보고한 경우 제외되지 않았습니다. 본 연구는 서부 노르웨이 의학 연구 윤리 지역 위원회(REK)의 승인을 받았습니다(2017/1650/REK Nord). 연구에 포함되기 전에 모든 환자로부터 사전 동의를 얻었습니다. 분석에 포함된 부위의 임상 검사 제3대구치를 제외한 각 치아의 네 부위에서 탐침 치주낭 깊이(PPD), 임상 부착 소실(CAL), 탐침 시 출혈(BOP)을 측정하였으며, 진단은 첫 선별 방문 시 한 명의 치주과 전문의에 의해 수행되었습니다. 흡연 습관과 당뇨병에 관한 정보가 수집되었습니다. 치은열구액(GCF) 샘플링은 선별 후 결정되었으며 각 환자당 하나의 얕은 치주낭(≤4mm)과 하나의 깊은 치주낭(≥5mm)을 포함했습니다. 깊은 치주낭을 가진 치아만, 치주과 전문의가 치료의 세 시점 이후에도 지속될 것으로 추정한 경우, 기준선(T0)에서 NSPT 전 샘플링을 위해 선택되었습니다. GCF는 T0에서 얕은 치주낭과 깊은 치주낭에서, 그리고 T1과 T2에서 NSPT 전 깊은 치주낭에서 수집되었습니다.

동일한 치주과 전문의가 모든 환자를 NSPT로 검사하고 치료하며 GCF 샘플을 수집했습니다. GCF는 각 시점에서 치경상 치태 제거 후 큐렛으로 제거하고, 타액 오염을 방지하기 위해 솜 롤로 치아를 격리한 후 수집되었습니다. GCF 샘플은 여과지 스트립(PerioPaper, OraFlow Inc., Hewlett, New York, USA)을 사용하여 수집되었으며, 잇몸 아래로 약한 저항이 느껴질 때까지 30초 동안 삽입되었습니다. 스트립은 즉시 에펜도르프 튜브로 옮겨져 추가 분석까지 -80°C에 보관되었습니다. 스트립이 들어 있는 튜브는 샘플링 전후에 Mettler Toledo AT261(DeltaRange®, Switzerland 가독성: 0.01mg)를 사용하여 무게를 측정하여 GCF 부피를 얻었으며, 공식 부피 = 질량(1μl = 1mg)을 사용했습니다. 깊은 치주낭과 얕은 치주낭의 샘플은 별도의 에펜도르프 튜브에 보관되었습니다. 단백질 용출을 위해 최종 농도 12mM(pH 7.6)의 Tris-HCL 완충액(200μl)이 각 튜브에 추가되었습니다. 각 샘플의 총 단백질 농도는 공급업체 지침에 따라 NanoDrop Lite Plus Micro-UV Spectrophotometer(Thermo Fisher Scientific, Wilmington, DE, USA)를 사용하여 측정되었습니다. 비드 기반 면역 분석 상용 비드 기반 면역 분석 Bio-Rad(카탈로그 번호 # 171AK99MR2, BioRad, Hercules, CA, USA)를 사용하여 40가지 케모카인/사이토카인의 수준을 pg/ml 단위로 측정했습니다. 또한, VEGF-C는 Milliplex 패널(카탈로그 번호 # HAGP1MAG-12K, Merck KGaA, Darmstadt, Germany)을 사용하여 분석했습니다. 모든 다중 면역 분석 패널에 대해 제조업체의 프로토콜을 따랐습니다. 각 측정 전에 시스템의 교정과 검증을 수행하여 비드 판독의 정확성과 신뢰성을 보장했습니다. 각 분석물에 대한 표준 곡선은 Bio-Plex 관리자 소프트웨어(버전 6.0, BioRad)를 사용한 5-모수 로지스틱 회귀 곡선을 사용하여 분석되었습니다. 이상치는 시스템에 의해 제거되었습니다.

통계 분석 모든 분석은 R v4.5.2(28)에서 수행되었습니다. 플롯은 R(29)의 ggplot2 패키지를 사용하여 생성되었습니다. 연구 참가자의 인구통계학적 특성을 요약하기 위해 평균, 표준 오차(SE), 중앙값 및 백분율을 포함한 기술 통계가 사용되었습니다. 기준선(T0) 깊은 대 얕은 치주낭 비교: 치주낭 깊이와 흡연 상태의 영향을 평가하기 위해 R(30)의 lme4 패키지에서 lmer() 함수를 사용하여 혼합 효과 모델을 적합시켰습니다. 고정 효과에 대한 P-값은 lmerTest 패키지(31)로 얻었습니다. 혼합 효과 접근법은 개인 내 짝지어진 샘플링(환자당 하나의 얕은 치주낭과 하나의 깊은 치주낭)으로 인한 종속성을 고려하기 위해 선택되었으며, 개인별 랜덤 절편이 랜덤 효과로 포함되었습니다. 모델은 예측 변수로 치주낭 깊이(얕은 대 깊은), 흡연 상태 및 이들의 상호작용을 포함했습니다; 상호작용 항은 명확하게 유의하지 않을 때(P≥0.1) 제거되었습니다. 표본 크기 제약으로 인해 성별과 연령은 주요 모델에 공변량으로 포함되지 않았지만, 그들의 잠재적 영향은 별도 분석에서 탐색되었습니다. 종단 분석; 반복 치료의 효과 깊은 치주낭에서 NSPT 후 PPD, CAL, 케모카인 발현 및 GCF 부피의 변화를 평가하기 위해 기준선(T0), 추적 관찰 1(T1), 추적 관찰 2(T2)의 세 시점에서 수집된 반복 측정값을 분석했습니다. 각 측정값은 각 환자 내 동일한 부위에서 얻어져 개인당 세 번의 관찰값을 산출했습니다. 따라서 우리는 위에서 설명한 동일한 유형의 혼합 효과 모델을 적용했으며, 치주낭 깊이를 순서형 범주 예측 변수(수준: T0, T1, T2)로 반복 NSPT로 대체했습니다. NSPT 효과의 대안으로, 우리는 각 염증 마커에 대해 T0에서 T2로 개선을 보인 개인의 비율을 계산했습니다. 개인은 NSPT 후 감소를 보인 경우 성공으로 분류되었습니다. 각 마커에 대해, 우리는 이항 검정을 사용하여 성공 비율을 검정했으며, 귀무 가설로 p=0.5(즉, 성공과 실패의 무작위 분포)를 가정했습니다. 분석은 흡연자와 비흡연자, 그리고 결합된 표본에 대해 별도로 수행되었습니다. VEGF-C 측정값의 분포 특성, 특히 0 값의 높은 비율을 고려하여 데이터는 두 범주로 이분화되었습니다: 미검출(0)과 검출(1). 이 이분 결과는 R의 lme4 패키지에서 glmr() 함수를 통해 구현된 이항 오차 분포를 가진 일반화 선형 혼합 효과 모델(GLMM)을 사용하여 분석되었습니다. VEGF-C에 대한 흡연 상태, 성별 또는 연령의 영향은 평가되지 않았습니다.