Effect van niet-chirurgische behandeling van parodontitispatiënten met focus op ontstekingsmediatoren in gingivale crevicevloeistof (NONSURG)

Parodontitis wordt geïnitieerd door een dysbiotisch microbioom dat het tandoppervlak in de parodontale pocket koloniseert, wat chronische ontsteking in de parodontale weefsels induceert en vervolgens leidt tot de vernietiging en het verlies van tand-ondersteunende weefsels. Ernstige parodontitis treft een aanzienlijk deel van de wereldbevolking en kan leiden tot tandverlies. De immuunreacties van de gastheer in de parodontale weefsels zijn verantwoordelijk voor de cascade van gebeurtenissen die leiden tot botverlies. In door parodontitis aangetast gingivaweefsel produceren infiltrerende immuuncellen en residente gingivale cellen cytokines en matrix-afbrekende enzymen om parodontopathogenen te elimineren. Gingivacreviculair vocht (GCF) is een locatiespecifiek exsudaat dat in ontstoken gingiva dient als een weerspiegeling van het ontstekingsproces dat daar plaatsvindt, en ontstekingscytokines zoals IL-6, IFN-γ, IL-β in GCF zijn in verband gebracht met de ernst van parodontitis. Bovendien is GCF een niet-invasief en gemakkelijk te verzamelen vocht om te analyseren. Chemokines zijn een gespecialiseerde subgroep van cytokines die voornamelijk de beweging van immuuncellen naar ontstekingsplaatsen dirigeren via chemotaxis. De homing van neutrofielen is een zeer selectief proces waarbij de expressie van specifieke neutrofielchemoattractanten, zoals CXCL1, CXCL2 en CXCL8, een belangrijke rol speelt in de pathogenese van parodontitis. Bovendien wordt gerapporteerd dat macrofagen een spectrum van activering hebben, variërend van pro-inflammatoir tot anti-inflammatoir, bij parodontale ziekte. Macrofagenmigratieremmende factor (MIF) speelt een cruciale rol bij het handhaven van macrofaaghomeostase. Het wordt gerapporteerd diverse functies te hebben, met zowel beschermende als schadelijke effecten op het ontstekingsproces, botmetabolisme, angiogenese en apoptose. Vasculair endotheelgroeifactor-C (VEGF-C) is een belangrijk familielid van de vasculaire endotheelgroeifactorfamilie, dat de groei van bloed- en lymfevaten versnelt. Verder worden de groei (lymfangiogenese) en remodelering van lymfevaten onder pathologische omstandigheden beïnvloed door chemokines en hun receptoren die worden uitgedrukt door lymfatische endotheelcellen (LECs) binnen en rond het aangetaste weefsel. Lymfangiogenese is in verband gebracht met parodontale ontsteking bij muizen. Bij mensen is CCL21, een ligand dat belangrijk is voor dendritische celmigratie, gedownreguleerd in lymfevaten van patiënten met parodontitis. VEGF-C-niveau is gekoppeld aan een slechte prognose bij kanker, en studies hebben gerapporteerd dat de expressie van MIF en VEGF-C sterk gecorreleerd zijn. Voor zover wij weten, is VEGF-C-expressie in menselijk GCF nog nooit onderzocht. Bij patiënten die niet-chirurgische parodontale therapie (NSPT) ondergaan, is het doel van de behandeling om ontsteking te beheersen en genezing van het parodontale weefsel te bevorderen door het herstellen van het normale microbioom. Bij rokers werd eerder een belemmerde genezingsreactie na NSPT gerapporteerd. Roken lijkt de microbiële samenstelling te moduleren en kolonisatie van belangrijke parodontale pathogenen te bevorderen. Opkomend bewijs suggereert dat bepaalde cytokines en chemokines in GCF veelbelovende biomarkers zijn voor het bepalen van de pathogenese, prognose van parodontitis en respons op NSPT. In deze studie analyseerden onderzoekers de expressie van chemokines/cytokines en VEGF-C in GCF van rokers en niet-rokers met ernstige parodontitis binnen diepe pockets voor en tijdens NSPT. Op baseline vergeleken onderzoekers ook de niveaus van deze markers tussen ondiepe en diepe parodontale pockets bij rokers en niet-rokers.

Materiaal en methoden Studiepopulatie: Personen die werden verwezen naar de specialistische kliniek van het Oral Health Centre of Expertise, West-Noorwegen voor parodontale behandeling, werden uitgenodigd om deel te nemen aan deze studie. Inclusiecriteria waren proefpersonen gediagnosticeerd met stadium III en IV parodontitis volgens het EFP/AAP-classificatiesysteem. Alle in aanmerking komende deelnemers (n=30, leeftijd >16 jaar) werden gevraagd naar hun rookgeschiedenis en werden geïdentificeerd als rokers als ze de afgelopen 5 jaar rookten. Proefpersonen werden uitgesloten als ze antibiotica-gebruik in de afgelopen 6 maanden, zwangerschap, borstvoeding, chronische hoge-dosis steroïdentherapie, bestraling of immunosuppressieve therapie rapporteerden. Ze werden niet uitgesloten als ze goed gereguleerde diabetes rapporteerden. Deze studie werd goedgekeurd door de Regionale Commissie voor Medisch Onderzoek Ethiek in West-Noorwegen (REK), 2017/1650/REK Nord. Geïnformeerde toestemming werd verkregen van alle patiënten voor inclusie in de studie.Klinisch onderzoek van locaties opgenomen in de analyseSondediepte (PPD), klinisch aanhechtingsverlies (CAL) en bloeding bij sonderen (BOP) werden gemeten op vier locaties per tand behalve derde molaren, en diagnose werd uitgevoerd door één parodontoloog tijdens het eerste screeningsbezoek. Informatie over rookgewoonten en diabetes werd verzameld. Monstername van gingivacreviculair vocht (GCF) werd bepaald na de screening en omvatte één ondiepe pocket (≤4mm) en één diepe pocket (≥5 mm) voor elke patiënt. Alleen tanden met diepe pockets, geschat door de parodontoloog om na de drie tijdstippen van behandeling te blijven bestaan, werden geselecteerd voor monstername vóór NSPT op baseline (T0). GCF werd verzameld uit ondiepe en diepe pockets op T0, en uit diepe pockets op T1 en T2 vóór NSPT.

Dezelfde parodontoloog onderzocht en behandelde alle patiënten met NSPT en verzamelde de GCF-monsters. GCF werd verzameld op elk tijdstip na verwijdering van supragingivale plaque met curette, en tanden werden geïsoleerd met wattenrollen om besmetting met speeksel te voorkomen. GCF-monsters werden verzameld met filterpapierstroken (PerioPaper, OraFlow Inc., Hewlett, New York, USA) die subgingivaal werden ingebracht totdat er zachte weerstand was, gedurende 30s. Stroken werden onmiddellijk overgebracht naar Eppendorf-buisjes en werden opgeslagen bij -80 °C tot verdere analyse. De buisjes met stroken werden gewogen met Mettler Toledo AT261 (DeltaRange®, Zwitserland leesbaarheid: 0,01mg) voor en na monstername om GCF-volume te verkrijgen, met behulp van de formule volume gelijk aan massa (één µl gelijk aan één mg). De monsters van diepe en ondiepe pockets werden in aparte Eppendorf-buisjes bewaard. Tris-HCL-buffer (200 µl) met een eindconcentratie 12mM (pH 7,6) werd toegevoegd aan elke buis voor eiwitelutie. Totale eiwitconcentratie voor elk monster werd gemeten met de NanoDrop Lite Plus Micro-UV Spectrofotometer (Thermo Fisher Scientific, Wilmington, DE, USA) volgens de instructies van de leverancier. Kraalgebaseerde immunoassay Met commercieel verkrijgbare kraalgebaseerde immunoassay Bio-Rad (catalogusnummer # 171AK99MR2, BioRad, Hercules, CA, USA), werden niveaus van 40 chemokines/cytokines bepaald in pg/ml. Daarnaast werd VEGF-C geanalyseerd met Milliplex-paneel (catalogusnummer # HAGP1MAG-12K, Merck KGaA, Darmstadt, Duitsland). Fabrikantsprotocollen werden gevolgd voor alle multiplex immunoassay-panelen. Voor elke meting werden kalibratie en validatie van het systeem uitgevoerd om nauwkeurigheid en betrouwbaarheid van de kraalmetingen te waarborgen. De standaardcurve voor elke analyte werd geanalyseerd met vijf-parametrische logistische regressiecurves met Bio-Plex manager software (versie 6.0, BioRad). Uitschieters werden verwijderd door het systeem.

Statistische analyseAlle analyses werden uitgevoerd in R v4.5.2 (28). Grafieken werden gemaakt met het ggplot2-pakket in R (29). Beschrijvende statistieken inclusief gemiddelde, standaardfout (SE), mediaan en percentages werden gebruikt om de demografische kenmerken van de studiedeelnemers samen te vatten. Baseline (T0) vergelijkingen van diepe vs ondiepe pockets:Om de effecten van pocketdiepte en rookstatus te evalueren, pasten we mixed-effects modellen toe met de lmer() functie van het lme4-pakket in R (30) P-waarden voor vaste effecten werden verkregen met het lmerTest-pakket (31). Een mixed-effects benadering werd gekozen om afhankelijkheid geïntroduceerd door gepaarde monstername binnen individuen (één ondiepe en één diepe parodontale pocket per patiënt) te verantwoorden, met individuele random intercepts opgenomen als het random effect. Het model omvatte pocketdiepte (ondiep vs diep), rookstatus en hun interactie als voorspellers; de interactieterm werd verwijderd wanneer duidelijk niet-significant (P≥0,1). Vanwege steekproefomvangbeperkingen werden geslacht en leeftijd niet opgenomen als covariaten in de primaire modellen, hoewel hun potentiële invloed werd onderzocht in aparte analyses. Longitudinale analyse; effecten van herhaalde behandeling Om veranderingen in PPD, CAL, chemokine-expressie en GCF-volume na NSPT in diepe pockets te evalueren, analyseerden we herhaalde metingen verzameld op drie tijdstippen: baseline (T0), follow-up 1 (T1) en follow-up 2 (T2). Elke meting werd verkregen van dezelfde locatie binnen elke patiënt, wat drie observaties per individu opleverde. Dienovereenkomstig pasten we hetzelfde type mixed-effects modellen toe als hierboven beschreven, waarbij pocketdiepte werd vervangen door herhaalde NSPT als een geordende categorische voorspeller (niveaus: T0, T1, T2). Als een alternatief voor NSPT-effecten berekenden we het aandeel individuen die verbetering vertoonden van T0 naar T2 voor elke inflammatoire marker. Individuen werden geclassificeerd als succesvol als ze een reductie vertoonden na NSPT. Voor elke marker testten we het aandeel successen met een binomiale test, uitgaande van een nulhypothese van p=0,5 (d.w.z. een willekeurige verdeling van successen en mislukkingen). Analyses werden apart uitgevoerd voor rokers en niet-rokers, evenals voor de gecombineerde steekproef.Gezien de distributiekenmerken van VEGF-C-metingen - specifiek, het hoge aandeel nulwaarden - werden de data gedichotomiseerd in twee categorieën: geen detectie (0) en detectie (1). Dit binaire resultaat werd geanalyseerd met een gegeneraliseerd lineair mixed-effects model (GLMM) met een binomiale foutverdeling, geïmplementeerd via de glmr() functie in het lme4-pakket voor R. Het effect van rookstatus, geslacht of leeftijd werd niet beoordeeld voor VEGF-C.