ネパール農村部における歯周病と小さな脆弱な新生児：地域ベースの試験

研究の目的：

本研究の第一の目的は、妊娠中の口腔衛生介入パッケージが、小さく脆弱な新生児（SVN）の発生率に与える影響を明らかにすることです。

• 仮説1a：口腔衛生介入は、SVNの全体的な発生率、および早産、在胎週数に比して小さい（SGA）、低出生体重（LBW）といった個別の転帰を減少させる。
• 仮説1b：介入は、若い／高齢の女性、栄養不良（低BMI、低食事多様性）、または登録時により重度の歯周病を有する女性などの高リスク群により大きな効果をもたらす。
• 仮説1c：介入へのアドヒアランスは、用量反応関係において、一次および二次アウトカムへの介入効果を修飾する。

目的2では、歯肉縁下の炎症、全身性炎症、およびSVNの発生率との関係を探る。

• 仮説2a：口腔衛生介入は、早期妊娠と後期妊娠の間で、介入群において歯肉縁下の炎症性メディエーター（IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-αなど）のレベルを、対照群の変化と比較して減少させる。
• 仮説2b：歯肉縁下炎症性メディエーターの低レベルは、SVNのリスク減少、在胎期間の短縮、および低出生体重・低出生時体重と関連する。
• 仮説2c：全身性炎症性メディエーターは、歯肉縁下炎症レベルがSVNおよび有害な妊娠転帰に及ぼす影響を媒介する。

研究デザイン：

この研究は、ネパールの農村部サルラヒ県において、地域に根ざした非盲検、世帯単位でランダム化された比較試験であり、口腔衛生介入パッケージがSVNタイプの人口レベルでの発生率に与える有効性を評価するものです。この試験には2,280人の妊婦が登録されます。

サブスタディ（n=200、各介入群100人）では、早期妊娠および後期妊娠において静脈血および歯肉溝滲出液（GCF：4箇所）を採取し、歯肉縁下炎症、全身性炎症、SVNおよび個別の有害妊娠転帰との関係を探ります。

介入群および対照群の一部の参加者は、早期（<14週）および後期妊娠（約32～34週）に歯周検査を受けます。

研究場所と参加者：

この研究は、ネパールのテライ地方の農村地域にある、ネパール栄養健康介入プロジェクト・サルラヒ（NNIPS）のフィールド調査サイトで実施されます。ネパールのテライ地方（低地平野）では、妊産婦の栄養不良、新生児死亡率、早産、SGA、LBWの割合が高くなっています。この地域は、南アジアの農村部で低所得の環境を代表しています。この地域では、新生児死亡率は高い（出生1000対32）です。

サルラヒ県内の5つの自治体（ハリプール、カビラシ、チャンドラナガル、チャッカルガッタ、イシュワルプール）をカバーする地理的な地域の世帯を対象にセンサスを実施し、生殖年齢の女性（センサス時に15～35歳）を特定します。同意を得た女性は、5週間ごとに自宅訪問で、前回の訪問以降の月経状態を評価されます。過去5週間に月経がないと報告した女性には妊娠検査が提供されます。陽性となり、妊娠確認時の最終月経（LMP）に基づき在胎週数が12週未満と推定される女性は、試験への参加を招待され、できるだけ早く登録されます。

ランダム化：

この研究では、世帯レベルでランダム化が行われます。ある世帯から最初の妊婦が特定され試験への同意を得た場合、その世帯は介入群または対照群に割り当てられます。この世帯から後に妊娠が確認され、登録期間内に妊娠した他の女性は、同じ群に割り当てられます。生体試料サブスタディの参加者は、試験登録の終盤に系統的に選択されます。

フィールド手順とデータ収集：

世帯センサス：フィールドインタビュアー（FI）が世帯センサスを実施します。FIは、Google Earthの衛星画像とGPS座標を使用して、すべての世帯をマッピングし、15～35歳の既婚女性を研究地域で列挙します。次に、各家庭を訪問し、世帯主から、世帯に15～35歳の既婚女性がいるかどうかを確認するための同意を求めます。研究者は、この方法で特定された女性に妊娠監視への参加を同意します。世帯センサス訪問時に不在だった世帯の女性は、研究名簿に追加され、最初の妊娠監視ラウンド中に妊娠監視のための同意を得るよう試みます。

妊娠監視訪問：地域健康研究ワーカー（CHRW）が5週間ごとに家庭訪問を行い、参加者の過去30日間の月経状態を評価し、尿ベースの妊娠検査を提供します。CHRWはNNIPSが雇用する地元の女性です。

登録訪問：CHRWから新しい妊娠の通知を受けたFIが登録訪問を実施します。この訪問で、FIはインフォームドコンセントを取得し、人口統計、社会経済、教育/識字率、妊娠・病歴、出生前ケア受診、栄養・食事多様性、世帯の食料安全保障、タバコ・アルコール使用、母性うつ病、口腔衛生行動、歯科医療受診に関するデータを収集するための質問票を実施し、人体計測（身長、体重、上腕周囲径、血圧、脈拍）を実施します。

超音波検査訪問：妊娠確認と登録同意後すぐに、准助産師（ANM）が参加者の自宅で超音波による在胎週数推定の訪問を行います。ANMはポータブル機器を使用し、INTERGROWTH 21st法に従って早期および後期の胎児在胎週数評価（頭殿長<14週、二頂骨径、頭囲、大腿骨長≥14週）を行います。

早期妊娠歯周検査訪問：介入群と対照群の半数がこの訪問を受けます。歯周検査員は、自宅で検査機器（歯科チェア、検査ライト、検査器具、サンプル採取キット、クールボックスなど）を設置します。これは全顎の歯周検査で、各歯6箇所（頬側および舌側の遠心、中央、近心面）のプロービング深さ（PPD）と、各歯2箇所（頬側および舌側の中央）のセメント・エナメル境から歯肉縁までの距離（CEJ-GM）を測定します（第三大臼歯を除く）。各象限のプロービング後、データ収集者は各歯の頬側および舌側表面におけるプロービング時の出血（BOP）の有無を評価します。PPD値は1mmから10mmまでの整数値で記録します。CEJ-GM距離も同様に0から10mmの値で記録します。遊離歯肉がCEJよりも歯冠側にある場合、CEJ-GM測定値は0と記録します。クリニカルアタッチメントロス（CAL）は、中央部位におけるPDとCEJ-GM距離の合計として計算します。

妊娠追跡訪問（介入群）：CHRWまたはFIは、介入群の女性を妊娠中に月2回訪問し、コンプライアンスを評価し、追加の洗浄剤、歯磨き粉、歯ブラシを提供し、母体の疾病に関するデータを収集します。これらの訪問で、データ収集者は定期的に口腔洗浄と歯磨き行動の観察を依頼します。参加者が質問がある場合や行動を改善する必要がある場合、データ収集者は指示の再確認を行います。

妊娠追跡訪問（対照群）：CHRWまたはFIは、対照群の女性を妊娠中に月1回訪問し、母体の疾病および出生前ケア受診に関するデータを収集します。初回訪問時に、データ収集者は女性に手動歯ブラシ、歯磨き粉、および口腔衛生に関する基本的な教育情報を提供します。

後期妊娠訪問：FIは、妊娠32～34週の間に後期妊娠訪問を実施し、母体の人体計測（登録時と同じ測定）、母体の疾病、出産計画に関する情報を収集します。

後期妊娠歯周検査訪問：介入群と対照群の半数がこの訪問を受け、介入が歯肉の健康を改善し炎症を軽減したかどうかを確認します。歯周検査員は早期妊娠と同じ検査を実施します。

出生通知：妊娠第三期の開始時に、データ収集者は妊娠参加者に、出産チームの携帯電話番号が記載されたカードと、出産が行われたらすぐにNNIPSスタッフに通知するよう指示を提供します。CHRWは妊娠終了に向けて各参加者を注意深く監視し、タイムリーな妊娠転帰の評価を確実にします。

出生評価訪問：専門の移動チーム（FI）が出産後72時間以内にできるだけ早く家庭または病院を訪問し、出産と分娩過程、早期の母乳育児と授乳行動、新生児ケアの初期慣行に関する情報を収集するための出生面談を実施します。チームが72時間以内に女性を訪問できない場合、可能な限り訪問し、出生および産褥早期の情報を収集し、人体計測測定を実施します。母体および乳児の体重（g）、身長（cm）、頭囲（cm）を測定します。体重はデジタルスケール（Tanita BD-585）で、身長はShort型ボードで、上腕周囲径は伸びない挿入テープで測定します。非デジタル測定は3回行い、中央値を分析に使用します。研究者は可能な限り、評価者を参加者の割り付けに対して盲検化するよう努めます。

サンプルサイズ：

この2群世帯ランダム化比較試験では、群間のSVN出生の発生率の相対減少15％を検出するために2,280の妊娠が必要です。このサンプルサイズを達成するために、研究者は24～36ヶ月の期間にわたり女性を登録します。以前のNNIPS試験のデータに基づき、研究者は対照群のSVN出生の有病率を47％、胎児死亡率18％、妊娠中の追跡不能率7％、および標準的な第一種過誤（5％）と第二種過誤（20％）を仮定します。

データ解析：

目的1の主解析では、intention-to-treatアプローチを使用して、介入パッケージが各群のSVN出生の割合に与える効果を決定します。研究者は、第一期中の産科超音波による在胎週数と、出生後72時間以内に収集された出生時体重を用いて主要および副次アウトカム変数を構築します。第一学期の超音波検査がない女性（まれ）については、第二学期の超音波検査またはLMPデータを使用します。出産後の人体計測訪問が72時間を超え10日以内に行われた母子ペアについては、過去の縦断研究のデータに基づき開発した早期新生児体重変化の経験的ベイズモデルを用いて、欠損した早期出生体重を補完します。このアルゴリズムは、母親の教育、年齢、産歴、単胎/多胎、乳児の性別、在胎週数、新生児生存状態などの変数に依存します。研究者は、全出産数および介入群別の出生数に対するSVN（早産（在胎37週未満）、SGA（INTERGROWTH-21st基準による在胎週数と性別の10パーセンタイル未満）、またはLBW（2500g未満）のいずれか）の割合、および各副次アウトカム（早産、SGA、LBW）の割合を計算します。研究者はヒストグラムと折れ線グラフを作成し、乳児の在胎週数、体重、在胎週数別サイズの連続測定値の分布を示します。

仮説1aを検定するために、混合効果対数二項回帰モデルを使用し、介入群の指標変数を用いて主要アウトカム（SVN出生）の相対リスクと95％信頼区間を推定します。必要に応じて試験デザインによるクラスタリングを考慮し、群間で不均衡な参加者因子を調整します。同様の解析アプローチを、早産、SGA出生、LBW出生の各二次アウトカムに対して別のモデルで適用します。研究者は、4カテゴリーのSVNタイプ（T+SGA、PT+AGA、PT+SGA）に対する介入効果を、混合効果多項ロジスティック回帰モデルを使用して探索します（T+AGAを参照）。

目的2では、PerioColストリップから炎症性メディエーター標本を標準容量の溶出液（希釈液43、Mesoscale Discovery）で溶出し、確立されたプロトコルに従って遠心分離します。カスタム96ウェルプレートマルチプレックス免疫測定法（U-PLEX、Meso Scale Discovery）を使用して、炎症メディエーター（少なくともIL-1β、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-17、IL-12p70、TNF-α、MIP-1α、CRP）をメーカーの標準の重複測定で定量します。これらのメディエーターは、歯周病と有害な妊娠転帰との因果経路に関与している可能性から選択されました。このリストは研究開始時の文献レビューにより確定されます。研究者はアッセイから各炎症メディエーターの総量を決定し、Periotron 8010の読み取りから得られたGCF量を用いて濃度を計算します。炎症メディエーターの分布の正規性をShapiro-Wilk検定で評価し、必要に応じてデータを変換します。炎症メディエーターの記述統計（平均±SD、中央値、四分位範囲）を算出し、散布図で表示します。介入群間でベースラインの炎症状態を比較し、不均衡がないか評価します。解析は必要な交絡因子と、Benjamini-Hochberg法を用いた多重比較のために調整されます。各炎症メディエーターについて以下のように個別に調査が行われます。

仮説2aを検定するために、研究者は介入群と対照群の間で、早期妊娠から後期妊娠にかけてのGCF炎症メディエーターレベルの変化の差を比較します。各炎症メディエーターに対して別々の混合効果線形回帰モデルを実行し、群間の中央値差と関連する95％信頼区間を、試験のクラスターデザインを考慮し多重比較を調整して推定します。研究者はまた、同様の回帰アプローチを用いて、後期妊娠における炎症メディエーターの中央値濃度（早期妊娠からの変化とは無関係）を介入群と対照群で比較します。