폐암 검출을 위한 LC-NMR 연구 바이오마커

피험자 컴퓨터 단층 촬영(CT) 스캔으로 발견되고 양전자 방출 단층 촬영(PET)/CT 스캔을 참조한 폐암 피험자가 포함됩니다. 폐암의 진단은 병리학적 생검을 통해 또는 방사선학적 또는 임상적 데이터와 관련하여 종양학 전문의에 의해 확인됩니다. 대조군은 심장 검사를 위해 핵의학과에 의뢰된 피험자로 구성됩니다. 이 대조군은 평균 모집단을 나타내며, 건강한 피험자와 암이 아닌 질병을 가진 환자로 구성되며 PET/CT 스캔을 거치지 않았습니다. 제외 기준은 다음과 같습니다: (1) 최소 6시간 동안 금식하지 않음, (2) 암 환자에서 제대로 조절되지 않는 당뇨병(공복 시 혈장 포도당 농도 ≥ 200 mg/dl), (3) 채혈 당일 약물 섭취 및 (4) 지난 5년 동안의 암 치료 또는 병력.

훈련 코호트는 폐암 환자 80명과 대조군 80명으로 구성됩니다. 검증 코호트는 폐암 환자 250명과 대조군 250명으로 구성됩니다.

혈액 샘플링 및 처리 공복 시 정맥혈 샘플(BD Vacutainer® LH 17 I.U. 10ml 튜브)을 수집하여 5~10분 이내에 4°C에서 보관합니다. 채혈 후 약 8시간이 지나면 혈액 샘플을 으깬 얼음에 담아 중앙 실험실로 옮기고 실온에서 원심분리합니다(스윙 버킷 원심분리기, 1600g, 15분). 이어서, 500 μl의 4개 혈장 분취량을 멸균 냉동 바이알로 옮기고 6개월 이내에 검사할 때까지 -80°C에서 보관합니다. 피험자가 생물학적 물질을 보관하도록 허가하면 3개의 분취액이 생물의학 연구 목적으로 University Biobank Limburg(UBiLim)에 보관됩니다.

NMR 분석에 앞서 플라즈마 분취량을 해동하고 보텍스 믹서를 사용하여 균질화합니다. 4°C에서 4분 동안 13000g에서 원심분리한 후(고정 회전자 Eppendorf 원심분리기 5415 R, 독일 함부르크), 혈장 분취량을 180µg을 함유하는 중수소 산화물(D2O, 99.9%, Cambridge Isotope Laboratories Inc, Andover, USA)에 희석합니다. /µl 트리메틸실릴-2,2,3,3-테트라듀테로프로피온산(TSP, 98%, Cambridge Isotope Laboratories Inc, Andover, USA)을 화학적 이동 기준으로 사용합니다. 마지막으로 준비된 혈장 샘플을 5mm NMR 튜브로 옮겨 분석합니다.

1H-NMR 분석 및 현재 공진 할당 1H-NMR 스펙트럼은 자기장 강도가 9.4 테슬라인 400 메가헤르츠(MHz) NMR 분광계(Varian/Agilent, Nuclear Magnetic Resonance Instruments, Palo Alto, California, USA)에 기록됩니다. 단백질 및 다당류와 같은 거대분자의 신호를 감쇠시키기 위해 CPMG(Carr-Purcell-Meiboom-Gill) 펄스 시퀀스를 사용하여 약간의 T2-가중 스펙트럼을 획득합니다. 또한 저분자량 대사산물의 최적 검출 및 정량화를 위해 수분 억제가 수행됩니다. 1H-NMR 스펙트럼은 수동으로 위상을 조정하고, 기준선을 수정하고 0.015ppm에서 TSP 공명을 기준으로 합니다. 현재 1H-NMR 공명의 지정은 스파이킹 실험을 통해 발생합니다. 참조 혈장 샘플은 혈장 100µl당 화합물 1mg의 농도로 34개의 알려진 대사 산물을 번갈아 첨가합니다. 획득한 화학적 이동은 Chenomx NMR 제품군 소프트웨어(버전 7.5, Chenomx Inc., Edmonton, Alberta, Canada)로 이중 확인됩니다. 마지막으로, 1H-NMR 스펙트럼은 나머지 물, TSP, 과당 및 글루코스 공명에 관계없이 모든 스펙트럼 영역의 총 적분 면적에 대해 적분되고 정규화되는 112개 스펙트럼 영역으로 나뉩니다. 최종 결과는 110개의 정규화된 통합 영역(물과 TSP를 제외한 모든 통합 영역)에 해당합니다.

통계 분석 처음에 모든 110 스펙트럼 영역의 통합 값은 폐암 환자와 대조군(IBM SPSS 버전 20.0, 미국 일리노이주 시카고). 둘째, 혈장의 대사 구성이 폐암 환자와 대조군을 구별할 수 있는지 여부를 조사하기 위해 SIMCA-P+(Version 12.0, Umetrics, Umea, Sweden)를 사용하여 다변량 통계 분석을 수행합니다. 비감독 주성분 분석(PCA)을 수행하여 데이터 세트 내의 고유 클러스터 및 이상값을 식별했습니다. (Hotelling의 T2 범위 플롯에 의해 감지된) 이상값을 제거한 후 직교 신호 보정 필터가 통합된 PLS-DA(부분 최소 제곱 판별 분석)의 확장인 직교 부분 최소 제곱 판별 분석(OPLS-DA)은 다음과 같습니다. 클래스 분리와 관련 없는 가변성을 제거하기 위해 수행됩니다. 예측된 분류는 특이성(실제로 대조군으로 분류된 대조군의 백분율) 및 민감도(실제로 폐암 환자로 분류된 폐암 환자의 백분율)로 표현됩니다. Benjamini-Hochberg의 다중 테스트에 대한 보정이 포함된 학생 t-테스트에서 얻은 상당히 다른 스펙트럼 영역의 통합 값을 사용한 결과를 모든 110 스펙트럼 영역의 통합 값을 사용한 결과와 비교합니다.