LC-NMR undersøgelse af biomarkører til påvisning af lungekræft

Forsøgspersoner Forsøgspersoner med lungekræft påvist ved en computertomografi (CT)-scanning og henvist til en positronemissionstomografi (PET)/CT-scanning er inkluderet. Diagnosen lungekræft bekræftes ved hjælp af en patologisk biopsi eller af en læge med speciale i onkologi med hensyn til radiologiske eller kliniske data. Kontrolgruppen består af forsøgspersoner, der blev henvist til afdeling Nuklearmedicin til undersøgelse af hjertet. Denne kontrolgruppe repræsenterer den gennemsnitlige befolkning, består af raske forsøgspersoner og patienter med ikke-cancersygdomme og har ikke gennemgået en PET/CT-scanning. Eksklusionskriterierne er som følger: (1) ikke fastet i mindst 6 timer, (2) dårligt kontrolleret diabetes (fastende plasmaglukosekoncentration ≥ 200 mg/dl) hos cancerpatienter, (3) medicinindtagelse på dagen for blodprøvetagning og (4) behandling eller historie med kræft i de foregående 5 år.

Træningskohorten består af 80 personer med lungekræft og 80 kontroller. Valideringskohorten består af 250 personer med lungekræft og 250 kontroller.

Blodprøvetagning og behandling Fastende venøse blodprøver (BD Vacutainer® LH 17 I.U. 10 ml rør) opsamles og opbevares ved 4°C inden for 5 til 10 minutter. Omkring 8 timer efter blodprøvetagning transporteres blodprøver på knust is til centrallaboratoriet og centrifugeres ved stuetemperatur (svingende spandcentrifuge, 1600 g, 15 minutter). Efterfølgende overføres 4 plasma-alikvoter på 500 µl til sterile kryoglas og opbevares ved -80°C indtil undersøgelse inden for 6 måneder. Når forsøgspersoner giver tilladelse til at opbevare deres biologiske materiale, opbevares 3 alikvoter på University Biobank Limburg (UBiLim) til biomedicinske forskningsformål.

Forud for NMR-analyse optøs plasmaalikvoter og homogeniseres ved hjælp af en vortexmixer. Efter centrifugering ved 13000 g i 4 minutter ved 4°C (fast rotor Eppendorf-centrifuge 5415 R, Hamborg, Tyskland), fortyndes plasmaalikvoter i deuteriumoxid (D2O, 99,9 %, Cambridge Isotope Laboratories Inc, Andover, USA) indeholdende 180 µg /µl trimethylsilyl-2,2,3,3-tetradeuteropropionsyre (TSP, 98%, Cambridge Isotope Laboratories Inc, Andover, USA) som reference for kemisk skift. Til sidst overføres de forberedte plasmaprøver til et 5 mm NMR-rør og analyseres.

1H-NMR-analyser og tildeling af nuværende resonanser 1H-NMR-spektrene er optaget på et 400 Megahertz (MHz) NMR-spektrometer (Varian/Agilent, Nuclear Magnetic Resonance Instruments, Palo Alto, Californien, USA) med en magnetisk feltstyrke på 9,4 Tesla ved 294 K. Let T2-vægtede spektre erhverves under anvendelse af en Carr-Purcell-Meiboom-Gill (CPMG) pulssekvens til at dæmpe signaler fra makromolekyler, såsom proteiner og polysaccharider. Derudover udføres vandundertrykkelse for at muliggøre optimal påvisning og kvantificering af metabolitter med lav molekylvægt. 1H-NMR-spektrene fases manuelt, baseline-korrigeres og refereres til TSP-resonansen ved 0,015 dele pr. million (ppm). Tildelingen af ​​de nuværende 1H-NMR-resonanser sker ved hjælp af spike-eksperimenter. En referenceplasmaprøve tilsættes skiftevis med 34 kendte metabolitter med en koncentration på 1 mg forbindelse pr. 100 µl plasma. De opnåede kemiske skift dobbelttjekkes med Chenomx NMR suite-software (version 7.5, Chenomx Inc., Edmonton, Alberta, Canada). Endelig er 1H-NMR-spektre opdelt i 112 spektralområder, som er integrerede og normaliserede i forhold til det samlede integrerede areal af alle spektralområder, uanset de resterende vand-, TSP-, fructose- og glucoseresonanser. Slutresultatet svarer til 110 normaliserede integrationsregioner (alle integrationsregioner undtagen vand og TSP).

Statistisk analyse Først analyseres integrationsværdierne for alle 110 spektrale regioner ved hjælp af en student t-test med korrektion for multiple test af Benjamini-Hochberg for at identificere dem, der adskiller sig signifikant mellem lungekræftpatienter og kontroller (IBM SPSS Version 20.0, Chicago, Illinois, USA). For det andet udføres multivariate statistiske analyser ved hjælp af SIMCA-P+ (Version 12.0, Umetrics, Umea, Sverige) for at undersøge, om den metaboliske sammensætning af blodplasma gør det muligt at skelne mellem lungekræftpatienter og kontroller. En uovervåget principal komponentanalyse (PCA) blev udført for at identificere iboende klynger og outliers i datasættet. Efter fjernelse af outliers (detekteret af en Hotellings T2-områdeplot), er en ortogonal partiel mindste kvadraters diskriminantanalyse (OPLS-DA), en udvidelse af partial mindste kvadraters diskriminantanalyse (PLS-DA) med et integreret ortogonalt signalkorrektionsfilter, udføres for at fjerne variabilitet, der ikke er relevant for klasseadskillelse. Den forudsagte klassificering er udtrykt som specificitet (procentdelen af ​​kontroller, der faktisk er klassificeret som kontroller) og sensitivitet (procentdelen af ​​lungekræftpatienter, der faktisk er klassificeret som lungekræftpatienter). Resultatet af at bruge integrationsværdierne for de signifikant forskellige spektralområder, opnået ved elevens t-test med korrektion for multiple test af Benjamini-Hochberg, sammenlignes med resultatet, hvor integrationsværdierne for alle 110 spektralområder blev brugt.