LC-NMR-studie biomarkører for å oppdage lungekreft

Forsøkspersoner Personer med lungekreft påvist ved en computertomografi (CT)-skanning og henvist til en positronemisjonstomografi (PET)/CT-skanning er inkludert. Diagnosen lungekreft bekreftes ved hjelp av en patologisk biopsi eller av en lege spesialisert i onkologi med hensyn til radiologiske eller kliniske data. Kontrollgruppen består av forsøkspersoner som ble henvist til avdeling Nukleærmedisin for undersøkelse av hjertet. Denne kontrollgruppen representerer gjennomsnittsbefolkningen, består av friske forsøkspersoner og pasienter med ikke-kreftsykdommer og har ikke gjennomgått en PET/CT-skanning. Eksklusjonskriterier er som følger: (1) ikke fastet i minst 6 timer, (2) dårlig kontrollert diabetes (fastende plasmaglukosekonsentrasjon ≥ 200 mg/dl) hos kreftpasienter, (3) medisininntak på dagen for blodprøvetaking og (4) behandling eller historie med kreft i de foregående 5 årene.

Treningskullet består av 80 personer med lungekreft og 80 kontroller. Valideringskohorten består av 250 personer med lungekreft og 250 kontroller.

Blodprøvetaking og behandling Fastende venøse blodprøver (BD Vacutainer® LH 17 I.U. 10 ml rør) samles og lagres ved 4°C innen 5 til 10 minutter. Rundt 8 timer etter blodprøvetaking transporteres blodprøver på knust is til sentrallaboratoriet og sentrifugeres ved romtemperatur (svingende bøttesentrifuge, 1600 g, 15 minutter). Deretter overføres 4 plasmaalikvoter på 500 µl til sterile kryovials og lagres ved -80°C frem til undersøkelse innen 6 måneder. Når forsøkspersoner gir tillatelse til å lagre sitt biologiske materiale, lagres 3 alikvoter ved University Biobank Limburg (UBiLim) for biomedisinske forskningsformål.

Før NMR-analyse blir plasmaalikvoter tint og homogenisert ved bruk av en virvelmikser. Etter sentrifugering ved 13000 g i 4 minutter ved 4°C (fast rotor Eppendorf-sentrifuge 5415 R, Hamburg, Tyskland), fortynnes plasmaalikvoter i deuteriumoksid (D2O, 99,9 %, Cambridge Isotope Laboratories Inc, Andover, USA) inneholdende 180 µg /µl trimetylsilyl-2,2,3,3-tetradeuteropropionsyre (TSP, 98 %, Cambridge Isotope Laboratories Inc, Andover, USA) som en referanse for kjemisk skift. Til slutt blir de forberedte plasmaprøvene overført til et 5 mm NMR-rør og analysert.

1H-NMR-analyser og tilordning av nåværende resonanser 1H-NMR-spektrene er registrert på et 400 Megahertz (MHz) NMR-spektrometer (Varian/Agilent, Nuclear Magnetic Resonance Instruments, Palo Alto, California, USA) med en magnetisk feltstyrke på 9,4 Tesla ved 294 K. Lett T2-vektede spektre erverves ved å bruke en Carr-Purcell-Meiboom-Gill (CPMG) pulssekvens for å dempe signaler fra makromolekyler, slik som proteiner og polysakkarider. I tillegg utføres vannundertrykkelse for å tillate optimal deteksjon og kvantifisering av metabolitter med lav molekylvekt. 1H-NMR-spektrene fases manuelt, baseline-korrigeres og refereres til TSP-resonansen ved 0,015 deler per million (ppm). Tildelingen av de nåværende 1H-NMR-resonansene skjer ved hjelp av spike-eksperimenter. En referanseplasmaprøve tilsettes vekselvis 34 kjente metabolitter med en konsentrasjon på 1 mg forbindelse per 100 µl plasma. De oppnådde kjemiske skiftene blir dobbeltsjekket med Chenomx NMR-programvare (versjon 7.5, Chenomx Inc., Edmonton, Alberta, Canada). Til slutt er 1H-NMR-spektra delt inn i 112 spektralområder, som er integrert og normalisert i forhold til det totale integrerte arealet til alle spektralområder, uavhengig av gjenværende vann-, TSP-, fruktose- og glukoseresonanser. Sluttresultatet tilsvarer 110 normaliserte integrasjonsregioner (alle integreringsregioner bortsett fra vann og TSP).

Statistisk analyse Først blir integrasjonsverdiene til alle 110 spektralregioner analysert ved hjelp av en student t-test med korreksjon for multippel testing av Benjamini-Hochberg for å identifisere de som skiller seg betydelig mellom lungekreftpasienter og kontroller (IBM SPSS versjon 20.0, Chicago, Illinois, USA). For det andre utføres multivariate statistiske analyser ved bruk av SIMCA-P+ (versjon 12.0, Umetrics, Umea, Sverige) for å undersøke om den metabolske sammensetningen av blodplasma gjør det mulig å skille mellom lungekreftpasienter og kontroller. En uovervåket hovedkomponentanalyse (PCA) ble utført for å identifisere iboende klynger og uteliggere i datasettet. Etter fjerning av uteliggere (oppdaget av en Hotellings T2-områdeplott), er en ortogonal partiell minste kvadraters diskriminantanalyse (OPLS-DA), en utvidelse av partiell minste kvadraters diskriminantanalyse (PLS-DA) med et integrert ortogonalt signalkorreksjonsfilter, utført for å fjerne variabilitet som ikke er relevant for klasseseparasjon. Den predikerte klassifiseringen uttrykkes som spesifisitet (prosentandelen av kontroller som faktisk er klassifisert som kontroller) og sensitivitet (prosentandelen av lungekreftpasienter som faktisk er klassifisert som lungekreftpasienter). Resultatet av å bruke integrasjonsverdiene til de signifikant forskjellige spektralområdene, oppnådd ved student-t-testen med korreksjon for multiple testing av Benjamini-Hochberg, sammenlignes med resultatet der integrasjonsverdiene til alle 110 spektralområdene ble brukt.