肺がんを検出するための LC-NMR 研究バイオマーカー

被験体 コンピュータ断層撮影（ＣＴ）スキャンによって検出され、陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）／ＣＴスキャンと呼ばれる肺癌を有する被験体が含まれる。 肺がんの診断は、病理学的生検によって、または腫瘍学を専門とする医師によって、放射線または臨床データに関して確認されます。 対照群は、心臓の検査のために核医学部門に紹介された被験者で構成されています。 この対照群は平均集団を表し、健康な被験者と非がん疾患の患者で構成され、PET / CTスキャンを受けていません。 除外基準は次のとおりです。(1) 少なくとも 6 時間絶食していない、(2) 癌患者でコントロール不良の糖尿病 (空腹時血漿グルコース濃度が 200 mg/dl 以上)、(3) 採血当日の薬物摂取、および(4)過去5年間のがんの治療または病歴。

トレーニング コホートは、80 人の肺がん患者と 80 人の対照で構成されています。 検証コホートは、肺がんの 250 人の被験者と 250 人のコントロールで構成されています。

採血と処理 空腹時静脈血サンプル (BD Vacutainer® LH 17 I.U. 10 ml チューブ) を採取し、4°C で 5 ～ 10 分以内に保存します。 採血の約 8 時間後、血液サンプルを砕いた氷の上で中央検査室に運び、室温で遠心分離します (スイングバケット遠心分離機、1600 g、15 分間)。 続いて、500 μl の 4 つの血漿アリコートを滅菌クライオバイアルに移し、6 か月以内の検査まで -80 °C で保存します。 被験者が生物学的材料を保存する許可を与えると、3つのアリコートが生物医学研究目的でリンブルフ大学バイオバンク(UBiLim)に保存されます。

NMR 分析の前に、ボルテックス ミキサーを使用してプラズマ アリコートを解凍し、均質化します。 13000 g で 4 分間、4°C で遠心分離した後 (固定ローター エッペンドルフ遠心分離機 5415 R、ハンブルグ、ドイツ)、血漿アリコートを重水素酸化物 (D2O、99.9%、Cambridge Isotope Laboratories Inc、アンドーバー、米国) で希釈し、180 μg を含むトリメチルシリル-2,2,3,3-テトラデューテロプロピオン酸 (TSP、98%、Cambridge Isotope Laboratories Inc、アンドーバー、米国) を化学シフト基準として /μl。 最後に、準備された血漿サンプルを 5 mm NMR チューブに移し、分析します。

1H-NMR 分析と現在の共鳴の割り当て 1H-NMR スペクトルは、磁場強度 9.4 テスラの 400 メガヘルツ (MHz) NMR 分光計 (Varian/Agilent、Nuclear Magnetic Resonance Instruments、Palo Alto、California、USA) で記録されます。 Carr-Purcell-Meiboom-Gill (CPMG) パルス シーケンスを使用して、タンパク質や多糖類などの高分子の信号を減衰させ、わずかに T2 強調スペクトルを取得します。 さらに、低分子量代謝物の最適な検出と定量化を可能にするために、水抑制が実行されます。 1H-NMR スペクトルは手動で調整され、ベースラインが補正され、0.015 百万分の 1 (ppm) で TSP 共鳴が参照されます。 現在の 1 H-NMR 共鳴の割り当ては、スパイク実験によって行われます。 参照血漿サンプルは、血漿 100 µl あたり化合物 1 mg の濃度で 34 の既知の代謝物と交互にスパイクされます。 得られた化学シフトは、Ｃｈｅｎｏｍｘ ＮＭＲスイートソフトウェア（バージョン７．５、Ｃｈｅｎｏｍｘ Ｉｎｃ．、エドモントン、アルバータ、カナダ）で二重チェックされる。 最後に、1H-NMR スペクトルは 112 のスペクトル領域に分割され、残りの水、TSP、フルクトース、およびグルコースの共鳴に関係なく、すべてのスペクトル領域の総統合面積に対して統合および正規化されます。 最終結果は、110 の正規化された積分領域 (水と TSP を除くすべての積分領域) に対応します。

統計分析 最初に、110 のスペクトル領域すべての積分値が、スチューデント t 検定によって分析され、Benjamini-Hochberg による多重検定の補正が行われ、肺がん患者と対照の間で有意に異なるものを特定します (IBM SPSS バージョン 20.0、米国イリノイ州シカゴ）。 次に、SIMCA-P + (バージョン 12.0、Umetrics、Umea、スウェーデン) を使用して多変量統計分析を実行し、血漿の代謝組成が肺がん患者と対照を区別できるかどうかを調べます。 データセット内の固有のクラスターと外れ値を特定するために、教師なし主成分分析 (PCA) が実行されました。 外れ値を除去した後 (ホテリングの T2 レンジ プロットで検出)、直交部分最小二乗判別分析 (OPLS-DA) は、統合された直交信号補正フィルターを使用した部分最小二乗判別分析 (PLS-DA) の拡張です。クラス分離に関係のない変動性を除去するために実行されます。 予測される分類は、特異度 (実際にコントロールとして分類されるコントロールのパーセンテージ) および感度 (実際に肺がん患者として分類される肺がん患者のパーセンテージ) として表されます。 Benjamini-Hochberg による多重検定の修正を伴うスチューデント t 検定によって得られた、有意に異なるスペクトル領域の積分値を使用した結果は、110 個すべてのスペクトル領域の積分値が使用された結果と比較されます。