Биомаркеры исследования LC-NMR для обнаружения рака легких

Субъекты Включены субъекты с раком легких, обнаруженным с помощью компьютерной томографии (КТ) и направленные на позитронно-эмиссионную томографию (ПЭТ)/КТ. Диагноз рака легкого подтверждается с помощью патологической биопсии или врач-онколог на основании рентгенологических или клинических данных. Контрольную группу составляют лица, направленные в отделение ядерной медицины для обследования сердца. Эта контрольная группа представляет собой среднюю популяцию, состоит из здоровых испытуемых и пациентов с неонкологическими заболеваниями и не подвергалась ПЭТ/КТ-сканированию. Критерии исключения следующие: (1) голодание не менее 6 часов, (2) плохо контролируемый диабет (концентрация глюкозы в плазме натощак ≥ 200 мг/дл) у онкологических больных, (3) прием лекарств в день забора крови и (4) лечение или история рака в предшествующие 5 лет.

Обучающая группа состоит из 80 человек с раком легких и 80 человек из контрольной группы. Проверочная когорта состоит из 250 человек с раком легких и 250 человек из контрольной группы.

Забор и обработка крови Образцы венозной крови натощак (пробирка BD Vacutainer® LH 17 I.U. 10 мл) собирают и хранят при 4°C в течение 5–10 минут. Примерно через 8 часов после забора крови образцы крови транспортируют на измельченном льду в центральную лабораторию и центрифугируют при комнатной температуре (центрифуга с вращающимся баком, 1600 г, 15 минут). Затем 4 аликвоты плазмы по 500 мкл переносят в стерильные криопробирки и хранят при -80°С до исследования в течение 6 месяцев. Когда субъекты дают разрешение на хранение своего биологического материала, 3 аликвоты хранятся в Университетском биобанке Лимбурга (UBiLim) для целей биомедицинских исследований.

Перед ЯМР-анализом аликвоты плазмы размораживают и гомогенизируют с помощью вихревого смесителя. После центрифугирования при 13000 g в течение 4 минут при 4°C (центрифуга Eppendorf с фиксированным ротором 5415 R, Гамбург, Германия) аликвоты плазмы разводят в оксиде дейтерия (D2O, 99,9%, Cambridge Isotope Laboratories Inc, Андовер, США), содержащем 180 мкг /мкл триметилсилил-2,2,3,3-тетрадейтеропропионовой кислоты (TSP, 98%, Cambridge Isotope Laboratories Inc, Андовер, США) в качестве эталона химического сдвига. Наконец, подготовленные образцы плазмы переносят в 5-мм ЯМР-пробирку и анализируют.

Анализы 1H-ЯМР и присвоение присутствующих резонансов. Спектры 1H-ЯМР записаны на спектрометре ЯМР 400 мегагерц (МГц) (Varian/Agilent, Nuclear Magnetic Resonance Instruments, Пало-Альто, Калифорния, США) с напряженностью магнитного поля 9,4 Тл. при 294 К. Слегка Т2-взвешенные спектры получают с использованием последовательности импульсов Карра-Перселла-Мейбум-Гилла (CPMG) для ослабления сигналов макромолекул, таких как белки и полисахариды. Кроме того, проводится подавление воды, чтобы обеспечить оптимальное обнаружение и количественное определение низкомолекулярных метаболитов. Спектры 1H-ЯМР фазированы вручную, базовая линия скорректирована и соотнесена с резонансом TSP при 0,015 частей на миллион (ppm). Присвоение настоящих резонансов 1H-ЯМР происходит с помощью экспериментов с пиками. В эталонный образец плазмы поочередно добавляют 34 известных метаболита с концентрацией 1 мг соединения на 100 мкл плазмы. Полученные химические сдвиги дважды проверяют с помощью пакета программного обеспечения Chenomx NMR (версия 7.5, Chenomx Inc., Эдмонтон, Альберта, Канада). Наконец, спектры 1H-ЯМР разделены на 112 спектральных областей, которые интегрируются и нормируются относительно общей интегрированной площади всех спектральных областей, независимо от резонансов оставшейся воды, TSP, фруктозы и глюкозы. Конечный результат соответствует 110 нормализованным областям интегрирования (все области интегрирования, кроме областей воды и TSP).

Статистический анализ Сначала значения интеграции всех 110 спектральных областей анализируются с помощью t-критерия Стьюдента с поправкой на множественное тестирование Бенджамини-Хохберга для выявления тех, которые значительно различаются между пациентами с раком легких и контрольной группой (IBM SPSS Version 20.0, Чикаго, Иллинойс, США). Во-вторых, с использованием SIMCA-P+ (версия 12.0, Umetrics, Umea, Швеция) проводится многомерный статистический анализ, чтобы выяснить, позволяет ли метаболический состав плазмы крови различать пациентов с раком легких и контрольную группу. Был проведен неконтролируемый анализ основных компонентов (PCA) для выявления внутренних кластеров и выбросов в наборе данных. После удаления выбросов (обнаруженных на графике диапазона Хотеллинга T2) выполняется ортогональный частичный дискриминантный анализ наименьших квадратов (OPLS-DA), расширение частичного дискриминантного анализа наименьших квадратов (PLS-DA) со встроенным фильтром коррекции ортогонального сигнала. выполняется для устранения изменчивости, не относящейся к разделению классов. Прогнозируемая классификация выражается как специфичность (процент контролей, которые фактически классифицируются как контроли) и чувствительность (процент пациентов с раком легких, которые фактически классифицируются как пациенты с раком легких). Результат использования значений интегрирования значительно отличающихся спектральных областей, полученных с помощью t-критерия Стьюдента с поправкой на множественное тестирование Бенджамини-Хохберга, сравнивается с результатом, в котором использовались значения интегрирования всех 110 спектральных областей.