Biomarkery badania LC-NMR w celu wykrycia raka płuc

Pacjenci Włączeni są pacjenci z rakiem płuc wykrytym za pomocą tomografii komputerowej (CT) i skierowani do pozytonowej tomografii emisyjnej (PET)/skanowania CT. Rozpoznanie raka płuca potwierdza biopsja patologiczna lub lekarz onkolog na podstawie danych radiologicznych lub klinicznych. Grupę kontrolną stanowili pacjenci, którzy zostali skierowani do Zakładu Medycyny Nuklearnej na badanie serca. Ta grupa kontrolna reprezentuje średnią populację, składa się z osób zdrowych i pacjentów z chorobami nienowotworowymi i nie została poddana badaniu PET/TK. Kryteria wykluczenia to: (1) brak postu przez co najmniej 6 godzin, (2) źle kontrolowana cukrzyca (stężenie glukozy na czczo ≥ 200 mg/dl) u chorych na nowotwory, (3) przyjmowanie leków w dniu pobrania krwi oraz (4) leczenie lub historia choroby nowotworowej w ciągu ostatnich 5 lat.

Kohorta szkoleniowa składa się z 80 osób z rakiem płuc i 80 osób z grupy kontrolnej. Kohorta walidacyjna składała się z 250 pacjentów z rakiem płuc i 250 osób z grupy kontrolnej.

Pobieranie i przetwarzanie krwi Próbki krwi żylnej na czczo (probówka BD Vacutainer® LH 17 I.U. 10 ml) są pobierane i przechowywane w temperaturze 4°C przez 5 do 10 minut. Około 8 godzin po pobraniu próbki krwi są transportowane na pokruszonym lodzie do laboratorium centralnego i odwirowywane w temperaturze pokojowej (wirówka z wychylnym kubłem, 1600 g, 15 minut). Następnie 4 porcje osocza po 500 µl przenosi się do sterylnych kriofiolek i przechowuje w temperaturze -80°C do badania w ciągu 6 miesięcy. Kiedy badani wyrażają zgodę na przechowywanie swojego materiału biologicznego, 3 porcje są przechowywane w Uniwersyteckim Biobank Limburg (UBiLim) do celów badań biomedycznych.

Przed analizą NMR porcje osocza rozmraża się i homogenizuje za pomocą mieszadła wirowego. Po wirowaniu przy 13000 g przez 4 minuty w 4°C (wirówka Eppendorf ze stałym wirnikiem 5415 R, Hamburg, Niemcy), próbki osocza rozcieńcza się w tlenku deuteru (D2O, 99,9%, Cambridge Isotope Laboratories Inc, Andover, USA) zawierającym 180 µg /µl kwasu trimetylosililo-2,2,3,3-tetradeuteropropionowego (TSP, 98%, Cambridge Isotope Laboratories Inc, Andover, USA) jako wzorzec przesunięcia chemicznego. Na koniec przygotowane próbki osocza przenosi się do 5 mm probówki NMR i analizuje.

Analizy 1H-NMR i przypisanie obecnych rezonansów Widma 1H-NMR są rejestrowane na spektrometrze NMR 400 Megaherców (MHz) (Varian/Agilent, Nuclear Magnetic Resonance Instruments, Palo Alto, Kalifornia, USA) przy natężeniu pola magnetycznego 9,4 Tesli w 294 K. Widma lekko ważone T2 są uzyskiwane przy użyciu sekwencji impulsów Carr-Purcell-Meiboom-Gill (CPMG) w celu osłabienia sygnałów makrocząsteczek, takich jak białka i polisacharydy. Dodatkowo przeprowadza się supresję wody, aby umożliwić optymalne wykrywanie i oznaczanie ilościowe metabolitów o niskiej masie cząsteczkowej. Widma 1H-NMR fazowano ręcznie, skorygowano linię bazową i odniesiono do rezonansu TSP przy 0,015 części na milion (ppm). Przypisanie obecnych rezonansów 1H-NMR następuje za pomocą eksperymentów wbijania. Referencyjną próbkę osocza wzbogaca się naprzemiennie 34 znanymi metabolitami w stężeniu 1 mg związku na 100 µl osocza. Otrzymane przesunięcia chemiczne są dwukrotnie sprawdzane za pomocą oprogramowania zestawu Chenomx NMR (wersja 7.5, Chenomx Inc., Edmonton, Alberta, Kanada). Wreszcie, widma 1H-NMR są podzielone na 112 regionów widmowych, które są całkowane i normalizowane względem całkowitego zintegrowanego obszaru wszystkich regionów widmowych, niezależnie od pozostałych rezonansów wody, TSP, fruktozy i glukozy. Wynik końcowy odpowiada 110 znormalizowanym regionom integracji (wszystkie regiony integracji z wyjątkiem wody i TSP).

Analiza statystyczna Najpierw wartości integracji wszystkich 110 regionów widmowych są analizowane za pomocą testu t-studenta z poprawką na testy wielokrotne przeprowadzone przez Benjaminiego-Hochberga w celu zidentyfikowania tych, które różnią się znacząco między pacjentami z rakiem płuc a grupą kontrolną (IBM SPSS wersja 20.0, Chicago, Illinois, Stany Zjednoczone). Po drugie, przeprowadza się wieloczynnikowe analizy statystyczne przy użyciu SIMCA-P+ (wersja 12.0, Umetrics, Umea, Szwecja) w celu zbadania, czy skład metaboliczny osocza krwi pozwala na rozróżnienie między pacjentami z rakiem płuc a grupą kontrolną. Przeprowadzono nienadzorowaną analizę głównych składowych (PCA) w celu zidentyfikowania wewnętrznych klastrów i wartości odstających w zbiorze danych. Po usunięciu wartości odstających (wykrytych na wykresie rozstępów T2 Hotellinga) następuje ortogonalna analiza dyskryminacyjna cząstkowych najmniejszych kwadratów (OPLS-DA), będąca rozszerzeniem analizy dyskryminacyjnej cząstkowych najmniejszych kwadratów (PLS-DA) ze zintegrowanym ortogonalnym filtrem korekcji sygnału przeprowadzane w celu usunięcia zmienności nieistotnej dla separacji klas. Przewidywana klasyfikacja jest wyrażona jako specyficzność (odsetek kontroli, które są faktycznie sklasyfikowane jako kontrole) i czułość (odsetek pacjentów z rakiem płuc, którzy są faktycznie sklasyfikowani jako pacjenci z rakiem płuc). Wynik zastosowania wartości integracji znacząco różnych obszarów widmowych, uzyskany za pomocą testu t-Studenta z poprawką na wielokrotne testowanie przez Benjaminiego-Hochberga, jest porównywany z wynikiem, w którym zastosowano wartości integracji wszystkich 110 obszarów widmowych.