Biomarcadores del estudio LC-NMR para detectar el cáncer de pulmón

Sujetos Se incluyen sujetos con cáncer de pulmón detectado mediante una tomografía computarizada (TC) y remitidos a una tomografía por emisión de positrones (PET)/TC. El diagnóstico de cáncer de pulmón se confirma mediante una biopsia patológica o por un médico especialista en oncología con respecto a datos radiológicos o clínicos. El grupo de control está formado por sujetos que fueron remitidos al departamento de Medicina Nuclear para un examen del corazón. Este grupo de control representa la población promedio, está formado por sujetos sanos y pacientes con enfermedades no cancerosas y que no se sometieron a una exploración PET/CT. Los criterios de exclusión son los siguientes: (1) no ayunar durante al menos 6 horas, (2) diabetes mal controlada (concentración de glucosa en plasma en ayunas ≥ 200 mg/dl) en pacientes con cáncer, (3) ingesta de medicamentos el día de la muestra de sangre y (4) tratamiento o antecedentes de cáncer en los 5 años anteriores.

La cohorte de entrenamiento consta de 80 sujetos con cáncer de pulmón y 80 controles. La cohorte de validación consta de 250 sujetos con cáncer de pulmón y 250 controles.

Muestreo y procesamiento de sangre Las muestras de sangre venosa en ayunas (tubo de 10 ml BD Vacutainer® LH 17 I.U.) se recolectan y almacenan a 4 °C en 5 a 10 minutos. Aproximadamente 8 horas después de la extracción de sangre, las muestras de sangre se transportan sobre hielo picado al laboratorio central y se centrifugan a temperatura ambiente (centrífuga de cubeta oscilante, 1600 g, 15 minutos). Posteriormente, se transfieren 4 alícuotas de plasma de 500 µl a crioviales estériles y se almacenan a -80 °C hasta su examen dentro de los 6 meses. Cuando los sujetos dan permiso para almacenar su material biológico, se almacenan 3 alícuotas en el Biobanco de la Universidad de Limburgo (UBiLim) con fines de investigación biomédica.

Antes del análisis de RMN, las alícuotas de plasma se descongelan y homogeneizan utilizando un mezclador de vórtice. Después de centrifugar a 13000 g durante 4 minutos a 4 °C (centrífuga Eppendorf de rotor fijo 5415 R, Hamburgo, Alemania), se diluyen alícuotas de plasma en óxido de deuterio (D2O, 99,9 %, Cambridge Isotope Laboratories Inc, Andover, EE. UU.) que contiene 180 µg /µl de ácido trimetilsilil-2,2,3,3-tetradeuteropropiónico (TSP, 98 %, Cambridge Isotope Laboratories Inc, Andover, EE. UU.) como referencia de desplazamiento químico. Finalmente, las muestras de plasma preparadas se transfieren a un tubo de RMN de 5 mm y se analizan.

Análisis de RMN de 1H y asignación de resonancias presentes Los espectros de RMN de 1H se registran en un espectrómetro de RMN de 400 megahercios (MHz) (Varian/Agilent, Nuclear Magnetic Resonance Instruments, Palo Alto, California, EE. UU.) con una intensidad de campo magnético de 9,4 Tesla a 294 K. Los espectros ligeramente ponderados en T2 se adquieren utilizando una secuencia de pulsos de Carr-Purcell-Meiboom-Gill (CPMG) para atenuar las señales de macromoléculas, como proteínas y polisacáridos. Además, la supresión de agua se realiza para permitir una detección y cuantificación óptimas de metabolitos de bajo peso molecular. Los espectros de 1H-RMN se escalonan manualmente, se corrige la línea base y se hace referencia a la resonancia TSP a 0,015 partes por millón (ppm). La asignación de las presentes resonancias 1H-NMR se realiza mediante experimentos de picos. Una muestra de plasma de referencia se enriquece alternativamente con 34 metabolitos conocidos con una concentración de 1 mg de compuesto por 100 µl de plasma. Los desplazamientos químicos obtenidos se verifican dos veces con el software Chenomx NMR suite (Versión 7.5, Chenomx Inc., Edmonton, Alberta, Canadá). Finalmente, los espectros de 1H-NMR se dividen en 112 regiones espectrales, que se integran y normalizan en relación con el área total integrada de todas las regiones espectrales, independientemente de las resonancias restantes de agua, TSP, fructosa y glucosa. El resultado final corresponde a 110 regiones de integración normalizadas (todas las regiones de integración excepto las de agua y TSP).

Análisis estadístico Al principio, los valores de integración de las 110 regiones espectrales se analizan mediante una prueba t de Student con corrección para pruebas múltiples de Benjamini-Hochberg para identificar aquellas que difieren significativamente entre los pacientes con cáncer de pulmón y los controles (IBM SPSS Versión 20.0, Chicago, Illinois, Estados Unidos). En segundo lugar, se realizan análisis estadísticos multivariantes utilizando SIMCA-P+ (Versión 12.0, Umetrics, Umea, Suecia) para investigar si la composición metabólica del plasma sanguíneo permite discriminar entre pacientes con cáncer de pulmón y controles. Se realizó un análisis de componentes principales (PCA) no supervisado para identificar grupos intrínsecos y valores atípicos dentro del conjunto de datos. Después de eliminar los valores atípicos (detectados por un gráfico de rango T2 de Hotelling), se realiza un análisis discriminante de mínimos cuadrados parciales ortogonales (OPLS-DA), una extensión del análisis discriminante de mínimos cuadrados parciales (PLS-DA) con un filtro de corrección de señal ortogonal integrado. realizado para eliminar la variabilidad no relevante para la separación de clases. La clasificación predicha se expresa como especificidad (el porcentaje de controles que en realidad se clasifican como controles) y sensibilidad (el porcentaje de pacientes con cáncer de pulmón que en realidad se clasifican como pacientes con cáncer de pulmón). El resultado de usar los valores de integración de las regiones espectrales significativamente diferentes, obtenidos por la prueba t de Student con corrección para pruebas múltiples de Benjamini-Hochberg, se compara con el resultado en el que se usaron los valores de integración de las 110 regiones espectrales.