LC-NMR-Studie Biomarker zum Nachweis von Lungenkrebs

Probanden Probanden mit Lungenkrebs, der durch einen Computertomographie (CT)-Scan erkannt und an einen Positronen-Emissions-Tomographie (PET)/CT-Scan überwiesen wurde, sind eingeschlossen. Die Diagnose Lungenkrebs wird durch eine pathologische Biopsie oder durch einen auf Onkologie spezialisierten Arzt anhand von radiologischen oder klinischen Daten bestätigt. Die Kontrollgruppe besteht aus Probanden, die zur Untersuchung des Herzens an die Abteilung Nuklearmedizin überwiesen wurden. Diese Kontrollgruppe stellt die durchschnittliche Bevölkerung dar, besteht aus gesunden Probanden und Patienten mit Nicht-Krebserkrankungen und wurde keinem PET/CT-Scan unterzogen. Ausschlusskriterien sind: (1) mindestens 6 Stunden nicht nüchtern, (2) schlecht eingestellter Diabetes (Nüchtern-Plasmaglukosekonzentration ≥ 200 mg/dl) bei Krebspatienten, (3) Medikamenteneinnahme am Tag der Blutentnahme und (4) Behandlung oder Vorgeschichte von Krebs in den vorangegangenen 5 Jahren.

Die Trainingskohorte besteht aus 80 Probanden mit Lungenkrebs und 80 Kontrollen. Die Validierungskohorte besteht aus 250 Probanden mit Lungenkrebs und 250 Kontrollen.

Blutentnahme und Verarbeitung Venöse Blutproben aus nüchternem Zustand (BD Vacutainer® LH 17 I.E. 10-ml-Röhrchen) werden entnommen und innerhalb von 5 bis 10 Minuten bei 4 °C gelagert. Etwa 8 Stunden nach der Blutentnahme werden die Blutproben auf zerstoßenem Eis ins Zentrallabor transportiert und bei Raumtemperatur zentrifugiert (Schwingbecherzentrifuge, 1600 g, 15 Minuten). Anschließend werden 4 Plasmaaliquots von 500 µl in sterile Kryovials überführt und bis zur Untersuchung innerhalb von 6 Monaten bei -80°C gelagert. Wenn die Probanden die Erlaubnis zur Aufbewahrung ihres biologischen Materials erteilen, werden 3 Aliquots in der University Biobank Limburg (UBiLim) für biomedizinische Forschungszwecke aufbewahrt.

Vor der NMR-Analyse werden Plasmaaliquots aufgetaut und unter Verwendung eines Vortex-Mischers homogenisiert. Nach Zentrifugation bei 13000 g für 4 Minuten bei 4°C (Eppendorf-Zentrifuge 5415 R mit festem Rotor, Hamburg, Deutschland) werden Plasmaaliquots in Deuteriumoxid (D2O, 99,9 %, Cambridge Isotope Laboratories Inc, Andover, USA) verdünnt, das 180 &mgr;g enthält /µl Trimethylsilyl-2,2,3,3-tetradeuteropropionsäure (TSP, 98 %, Cambridge Isotope Laboratories Inc, Andover, USA) als chemische Verschiebungsreferenz. Abschließend werden die aufbereiteten Plasmaproben in ein 5 mm NMR-Röhrchen überführt und analysiert.

1 H-NMR-Analysen und Zuordnung vorhandener Resonanzen Die 1 H-NMR-Spektren werden auf einem 400 Megahertz (MHz) NMR-Spektrometer (Varian/Agilent, Nuclear Magnetic Resonance Instruments, Palo Alto, Kalifornien, USA) bei einer Magnetfeldstärke von 9,4 Tesla aufgenommen bei 294 K. Leicht T2-gewichtete Spektren werden unter Verwendung einer Carr-Purcell-Meiboom-Gill (CPMG)-Pulssequenz aufgenommen, um Signale von Makromolekülen wie Proteinen und Polysacchariden abzuschwächen. Zusätzlich wird eine Wasserunterdrückung durchgeführt, um eine optimale Detektion und Quantifizierung von Metaboliten mit niedrigem Molekulargewicht zu ermöglichen. Die 1 H-NMR-Spektren werden manuell phasengesteuert, basislinienkorrigiert und auf die TSP-Resonanz bei 0,015 Teilen pro Million (ppm) referenziert. Die Zuordnung der vorliegenden 1H-NMR-Resonanzen erfolgt durch Spiking-Experimente. Eine Referenzplasmaprobe wird abwechselnd mit 34 bekannten Metaboliten in einer Konzentration von 1 mg Verbindung pro 100 µl Plasma versetzt. Die erhaltenen chemischen Verschiebungen werden mit der Chenomx-NMR-Suite-Software (Version 7.5, Chenomx Inc., Edmonton, Alberta, Kanada) doppelt überprüft. Schließlich werden 1H-NMR-Spektren in 112 Spektralbereiche unterteilt, die unabhängig von den verbleibenden Wasser-, TSP-, Fructose- und Glucose-Resonanzen integriert und relativ zur integrierten Gesamtfläche aller Spektralbereiche normiert werden. Das Endergebnis entspricht 110 normalisierten Integrationsregionen (alle Integrationsregionen außer denen von Wasser und TSP).

Statistische Analyse Zunächst werden die Integrationswerte aller 110 Spektralbereiche mittels eines Student t-Tests mit Korrektur für multiples Testen nach Benjamini-Hochberg analysiert, um diejenigen zu identifizieren, die sich signifikant zwischen Lungenkrebspatienten und Kontrollen unterscheiden (IBM SPSS Version 20.0, Chicago, Illinois, USA). Zweitens werden multivariate statistische Analysen mit SIMCA-P+ (Version 12.0, Umetrics, Umea, Schweden) durchgeführt, um zu untersuchen, ob die metabolische Zusammensetzung des Blutplasmas eine Unterscheidung zwischen Lungenkrebspatienten und Kontrollen erlaubt. Eine unüberwachte Hauptkomponentenanalyse (PCA) wurde durchgeführt, um intrinsische Cluster und Ausreißer innerhalb des Datensatzes zu identifizieren. Nach der Entfernung von Ausreißern (erkannt durch einen Hotelling-T2-Range-Plot) erfolgt eine Orthogonal-Partial-Least-Squares-Diskriminanzanalyse (OPLS-DA), eine Erweiterung der Partial-Least-Squares-Diskriminanzanalyse (PLS-DA) mit integriertem orthogonalem Signalkorrekturfilter durchgeführt, um Variabilität zu entfernen, die für die Klassentrennung nicht relevant ist. Die vorhergesagte Klassifizierung wird als Spezifität (Prozentsatz der Kontrollen, die tatsächlich als Kontrollen klassifiziert werden) und Sensitivität (Prozentsatz der Lungenkrebspatienten, die tatsächlich als Lungenkrebspatienten klassifiziert werden) ausgedrückt. Das Ergebnis der Verwendung der Integrationswerte der signifikant unterschiedlichen Spektralbereiche, erhalten durch den Student t-Test mit Korrektur für multiples Testen nach Benjamini-Hochberg, wird mit dem Ergebnis verglichen, bei dem die Integrationswerte aller 110 Spektralbereiche verwendet wurden.