Biomarqueurs d'étude LC-NMR pour détecter le cancer du poumon

Sujets Les sujets atteints d'un cancer du poumon détecté par une tomodensitométrie (TDM) et référés à une tomographie par émission de positrons (TEP)/TDM sont inclus. Le diagnostic de cancer du poumon est confirmé au moyen d'une biopsie pathologique ou par un médecin spécialisé en oncologie au regard des données radiologiques ou cliniques. Le groupe contrôle est constitué de sujets qui ont été référés au service de Médecine Nucléaire pour un examen du cœur. Ce groupe témoin représente la population moyenne, est composé de sujets sains et de patients atteints de maladies non cancéreuses et n'a pas subi de PET/CT-scan. Les critères d'exclusion sont les suivants : (1) non à jeun depuis au moins 6 heures, (2) diabète mal contrôlé (glycémie à jeun ≥ 200 mg/dl) chez les patients cancéreux, (3) prise de médicaments le jour du prélèvement sanguin et (4) traitement ou antécédents de cancer au cours des 5 années précédentes.

La cohorte d'entraînement est composée de 80 sujets atteints d'un cancer du poumon et de 80 témoins. La cohorte de validation est composée de 250 sujets atteints d'un cancer du poumon et de 250 témoins.

Prélèvement et traitement du sang Des échantillons de sang veineux à jeun (tube BD Vacutainer® LH 17 I.U. 10 ml) sont prélevés et conservés à 4 °C en 5 à 10 minutes. Environ 8 heures après le prélèvement sanguin, les échantillons de sang sont transportés sur glace pilée au laboratoire central et centrifugés à température ambiante (centrifugeuse à godet oscillant, 1600 g, 15 minutes). Par la suite, 4 aliquotes de plasma de 500 µl sont transférées dans des cryotubes stériles et conservées à -80°C jusqu'à examen dans les 6 mois. Lorsque les sujets autorisent le stockage de leur matériel biologique, 3 aliquotes sont stockées à la Biobanque universitaire du Limbourg (UBiLim) à des fins de recherche biomédicale.

Avant l'analyse RMN, les aliquotes de plasma sont décongelées et homogénéisées à l'aide d'un mélangeur vortex. Après centrifugation à 13000 g pendant 4 minutes à 4°C (centrifugeuse à rotor fixe Eppendorf 5415 R, Hambourg, Allemagne), les aliquotes de plasma sont diluées dans de l'oxyde de deutérium (D2O, 99,9 %, Cambridge Isotope Laboratories Inc, Andover, USA) contenant 180 µg /µl d'acide triméthylsilyl-2,2,3,3-tétradeutéropropionique (TSP, 98%, Cambridge Isotope Laboratories Inc, Andover, USA) comme référence de déplacement chimique. Enfin, les échantillons de plasma préparés sont transférés dans un tube RMN de 5 mm et analysés.

Analyses 1H-RMN et attribution des résonances présentes Les spectres 1H-RMN sont enregistrés sur un spectromètre RMN 400 Mégahertz (MHz) (Varian/Agilent, Nuclear Magnetic Resonance Instruments, Palo Alto, Californie, USA) avec une intensité de champ magnétique de 9,4 Tesla à 294 K. Des spectres légèrement pondérés en T2 sont acquis à l'aide d'une séquence d'impulsions Carr-Purcell-Meiboom-Gill (CPMG) pour atténuer les signaux des macromolécules, telles que les protéines et les polysaccharides. De plus, une suppression de l'eau est effectuée afin de permettre une détection et une quantification optimales des métabolites de faible poids moléculaire. Les spectres 1H-RMN sont mis en phase manuellement, la ligne de base corrigée et référencée à la résonance TSP à 0,015 partie par million (ppm). L'attribution des résonances 1H-RMN actuelles se produit au moyen d'expériences de dopage. Un échantillon de plasma de référence est dopé en alternance avec 34 métabolites connus avec une concentration de 1 mg de composé par 100 µl de plasma. Les déplacements chimiques obtenus sont revérifiés avec le logiciel de la suite Chenomx RMN (version 7.5, Chenomx Inc., Edmonton, Alberta, Canada). Enfin, les spectres 1H-RMN sont divisés en 112 régions spectrales, qui sont intégrées et normalisées par rapport à la zone intégrée totale de toutes les régions spectrales, indépendamment des résonances restantes de l'eau, du TSP, du fructose et du glucose. Le résultat final correspond à 110 régions d'intégration normalisées (toutes les régions d'intégration sauf celles de l'eau et du TSP).

Analyse statistique Dans un premier temps, les valeurs d'intégration de l'ensemble des 110 régions spectrales sont analysées au moyen d'un test t de Student avec correction pour les tests multiples par Benjamini-Hochberg afin d'identifier celles qui diffèrent significativement entre les patients atteints d'un cancer du poumon et les témoins (IBM SPSS Version 20.0, Chicago, Illinois, États-Unis). Deuxièmement, des analyses statistiques multivariées sont effectuées à l'aide de SIMCA-P + (version 12.0, Umetrics, Umea, Suède) pour déterminer si la composition métabolique du plasma sanguin permet de faire la distinction entre les patients atteints d'un cancer du poumon et les témoins. Une analyse en composantes principales (ACP) non supervisée a été effectuée pour identifier les grappes intrinsèques et les valeurs aberrantes dans l'ensemble de données. Après la suppression des valeurs aberrantes (détectées par un tracé de plage T2 de Hotelling), une analyse discriminante orthogonale des moindres carrés partiels (OPLS-DA), une extension de l'analyse discriminante des moindres carrés partiels (PLS-DA) avec un filtre de correction de signal orthogonal intégré, est effectué pour supprimer la variabilité non pertinente pour la séparation des classes. La classification prédite est exprimée sous forme de spécificité (le pourcentage de témoins qui sont effectivement classés comme témoins) et de sensibilité (le pourcentage de patients atteints d'un cancer du poumon qui sont effectivement classés comme patients atteints d'un cancer du poumon). Le résultat de l'utilisation des valeurs d'intégration des régions spectrales significativement différentes, obtenu par le test t de Student avec correction pour les tests multiples par Benjamini-Hochberg, est comparé au résultat dans lequel les valeurs d'intégration des 110 régions spectrales ont été utilisées.