Biomarcadores de estudo de LC-NMR para detectar câncer de pulmão

Indivíduos Indivíduos com câncer de pulmão detectado por uma tomografia computadorizada (CT) e encaminhados para uma tomografia por emissão de pósitrons (PET)/CT-scan estão incluídos. O diagnóstico de câncer de pulmão é confirmado por meio de biópsia patológica ou por médico especialista em oncologia com relação a dados radiológicos ou clínicos. O grupo controle é composto por indivíduos encaminhados ao serviço de Medicina Nuclear para exame do coração. Este grupo de controle representa a população média, consiste em indivíduos saudáveis ​​e pacientes com doenças não cancerígenas e não submetidos a PET/TC. Os critérios de exclusão são os seguintes: (1) não jejuar por pelo menos 6 horas, (2) diabetes mal controlado (concentração de glicose plasmática em jejum ≥ 200 mg/dl) em pacientes com câncer, (3) ingestão de medicamentos no dia da coleta de sangue e (4) tratamento ou história de câncer nos últimos 5 anos.

A coorte de treinamento consiste em 80 indivíduos com câncer de pulmão e 80 controles. A coorte de validação consiste em 250 indivíduos com câncer de pulmão e 250 controles.

Amostragem e processamento de sangue Amostras de sangue venoso em jejum (BD Vacutainer® LH 17 I.U. tubo de 10 ml) são coletadas e armazenadas a 4°C em 5 a 10 minutos. Cerca de 8 horas após a colheita de sangue, as amostras de sangue são transportadas em gelo picado para o laboratório central e centrifugadas à temperatura ambiente (centrífuga de balde oscilante, 1600 g, 15 minutos). Subsequentemente, 4 alíquotas de plasma de 500 µl são transferidas para criotubos estéreis e armazenadas a -80°C até exame dentro de 6 meses. Quando os sujeitos dão permissão para armazenar seu material biológico, 3 alíquotas são armazenadas no University Biobank Limburg (UBiLim) para fins de pesquisa biomédica.

Antes da análise de NMR, as alíquotas de plasma são descongeladas e homogeneizadas usando um misturador de vórtice. Após centrifugação a 13.000 g por 4 minutos a 4°C (centrífuga Eppendorf de rotor fixo 5415 R, Hamburgo, Alemanha), as alíquotas de plasma são diluídas em óxido de deutério (D2O, 99,9%, Cambridge Isotope Laboratories Inc, Andover, EUA) contendo 180 µg /µl ácido trimetilsilil-2,2,3,3-tetradeuteropropiônico (TSP, 98%, Cambridge Isotope Laboratories Inc, Andover, EUA) como referência de deslocamento químico. Finalmente, as amostras de plasma preparadas são transferidas para um tubo de RMN de 5 mm e analisadas.

Análises de 1H-NMR e atribuição das ressonâncias presentes Os espectros de 1H-NMR são registrados em um espectrômetro de NMR de 400 Megahertz (MHz) (Varian/Agilent, Nuclear Magnetic Resonance Instruments, Palo Alto, Califórnia, EUA) com uma intensidade de campo magnético de 9,4 Tesla a 294 K. Espectros levemente ponderados em T2 são adquiridos usando uma sequência de pulso Carr-Purcell-Meiboom-Gill (CPMG) para atenuar sinais de macromoléculas, como proteínas e polissacarídeos. Além disso, a supressão de água é realizada para permitir a detecção e quantificação ideais de metabólitos de baixo peso molecular. Os espectros 1H-NMR são escalonados manualmente, corrigidos pela linha de base e referenciados à ressonância TSP a 0,015 partes por milhão (ppm). A atribuição das presentes ressonâncias de 1H-NMR ocorre por meio de experimentos de adição. Uma amostra de plasma de referência é adicionada alternadamente com 34 metabólitos conhecidos com uma concentração de 1 mg de composto por 100 µl de plasma. Os desvios químicos obtidos são duplamente verificados com o software Chenomx NMR suite (Versão 7.5, Chenomx Inc., Edmonton, Alberta, Canadá). Finalmente, os espectros de 1H-NMR são divididos em 112 regiões espectrais, que são integradas e normalizadas em relação à área integrada total de todas as regiões espectrais, independentemente das ressonâncias restantes de água, TSP, frutose e glicose. O resultado final corresponde a 110 regiões de integração normalizadas (todas as regiões de integração exceto as de água e TSP).

Análise estatística Inicialmente, os valores de integração de todas as 110 regiões espectrais são analisados ​​por meio de um teste t de Student com correção para testes múltiplos de Benjamini-Hochberg para identificar aqueles que diferem significativamente entre pacientes com câncer de pulmão e controles (IBM SPSS versão 20.0, Chicago, Illinois, EUA). Em segundo lugar, análises estatísticas multivariadas são realizadas usando SIMCA-P+ (Versão 12.0, Umetrics, Umea, Suécia) para investigar se a composição metabólica do plasma sanguíneo permite discriminar entre pacientes com câncer de pulmão e controles. Uma análise de componente principal não supervisionada (PCA) foi realizada para identificar clusters intrínsecos e outliers dentro do conjunto de dados. Após a remoção dos outliers (detectados por um gráfico de intervalo T2 de Hotelling), uma análise discriminante de mínimos quadrados ortogonal parcial (OPLS-DA), uma extensão da análise discriminante de mínimos quadrados parciais (PLS-DA) com um filtro de correção de sinal ortogonal integrado, é realizada para remover a variabilidade não relevante para a separação de classes. A classificação prevista é expressa como especificidade (a porcentagem de controles que são realmente classificados como controles) e sensibilidade (a porcentagem de pacientes com câncer de pulmão que são realmente classificados como pacientes com câncer de pulmão). O resultado da utilização dos valores de integração das regiões espectrais significativamente diferentes, obtidos pelo teste t de Student com correção para testes múltiplos de Benjamini-Hochberg, é comparado ao resultado em que foram utilizados os valores de integração de todas as 110 regiões espectrais.