Biomarcatori di studio LC-NMR per rilevare il cancro ai polmoni

Soggetti Sono inclusi i soggetti con cancro del polmone rilevato da una tomografia computerizzata (TC) e riferiti a una tomografia a emissione di positroni (PET)/TC. La diagnosi di cancro del polmone è confermata mediante biopsia patologica o da un medico specialista in oncologia rispetto ai dati radiologici o clinici. Il gruppo di controllo è costituito da soggetti che sono stati indirizzati al reparto di Medicina Nucleare per un esame del cuore. Questo gruppo di controllo rappresenta la popolazione media, è costituito da soggetti sani e pazienti con patologie diverse dal cancro e non è stato sottoposto a scansione PET/TAC. I criteri di esclusione sono i seguenti: (1) non digiuno da almeno 6 ore, (2) diabete scarsamente controllato (concentrazione di glucosio plasmatico a digiuno ≥ 200 mg/dl) nei pazienti oncologici, (3) assunzione di farmaci il giorno del prelievo di sangue e (4) trattamento o anamnesi di cancro nei 5 anni precedenti.

La coorte di formazione è composta da 80 soggetti con cancro ai polmoni e 80 controlli. La coorte di convalida è composta da 250 soggetti con cancro ai polmoni e 250 controlli.

Prelievo e trattamento del sangue I campioni di sangue venoso a digiuno (BD Vacutainer® LH 17 I.U. provetta da 10 ml) vengono raccolti e conservati a 4°C entro 5-10 minuti. Circa 8 ore dopo la raccolta del sangue, i campioni di sangue vengono trasportati su ghiaccio tritato al laboratorio centrale e centrifugati a temperatura ambiente (centrifuga a secchiello oscillante, 1600 g, 15 minuti). Successivamente, 4 aliquote di plasma da 500 µl vengono trasferite in crioviali sterili e conservate a -80°C fino all'esame entro 6 mesi. Quando i soggetti danno il permesso di conservare il loro materiale biologico, 3 aliquote vengono conservate presso l'Università Biobank Limburg (UBiLim) per scopi di ricerca biomedica.

Prima dell'analisi NMR, le aliquote di plasma vengono scongelate e omogeneizzate utilizzando un miscelatore a vortice. Dopo centrifugazione a 13000 g per 4 minuti a 4°C (centrifuga Eppendorf a rotore fisso 5415 R, Amburgo, Germania), le aliquote di plasma vengono diluite in ossido di deuterio (D2O, 99,9%, Cambridge Isotope Laboratories Inc, Andover, USA) contenente 180 µg /µl di acido trimetilsilil-2,2,3,3-tetradeuteropropionico (TSP, 98%, Cambridge Isotope Laboratories Inc, Andover, USA) come riferimento per lo spostamento chimico. Infine, i campioni di plasma preparati vengono trasferiti in un tubo NMR da 5 mm e analizzati.

Analisi 1H-NMR e assegnazione delle risonanze presenti Gli spettri 1H-NMR sono registrati su uno spettrometro NMR da 400 Megahertz (MHz) (Varian/Agilent, Nuclear Magnetic Resonance Instruments, Palo Alto, California, USA) con un'intensità di campo magnetico di 9,4 Tesla a 294 K. Spettri leggermente pesati in T2 vengono acquisiti utilizzando una sequenza di impulsi Carr-Purcell-Meiboom-Gill (CPMG) per attenuare i segnali di macromolecole, come proteine ​​e polisaccaridi. Inoltre, viene eseguita la soppressione dell'acqua per consentire il rilevamento e la quantificazione ottimali dei metaboliti a basso peso molecolare. Gli spettri 1H-NMR vengono messi in fase manualmente, la linea di base corretta e riferita alla risonanza TSP a 0,015 parti per milione (ppm). L'assegnazione delle attuali risonanze 1H-NMR avviene mediante esperimenti di spiking. Un campione di plasma di riferimento viene addizionato alternativamente con 34 metaboliti noti con una concentrazione di 1 mg di composto per 100 µl di plasma. Gli spostamenti chimici ottenuti vengono ricontrollati con il software della suite Chenomx NMR (versione 7.5, Chenomx Inc., Edmonton, Alberta, Canada). Infine, gli spettri 1H-NMR sono divisi in 112 regioni spettrali, che sono integrate e normalizzate rispetto all'area integrata totale di tutte le regioni spettrali, indipendentemente dalle rimanenti risonanze di acqua, TSP, fruttosio e glucosio. Il risultato finale corrisponde a 110 regioni di integrazione normalizzate (tutte le regioni di integrazione tranne quelle dell'acqua e del TSP).

Analisi statistica Inizialmente, i valori di integrazione di tutte le 110 regioni spettrali vengono analizzati per mezzo di un t-test di Student con correzione per test multipli di Benjamini-Hochberg per identificare quelli che differiscono significativamente tra pazienti affetti da cancro del polmone e controlli (IBM SPSS versione 20.0, Chicago, Illinois, USA). In secondo luogo, vengono eseguite analisi statistiche multivariate utilizzando SIMCA-P+ (Versione 12.0, Umetrics, Umea, Svezia) per verificare se la composizione metabolica del plasma sanguigno consenta di discriminare tra pazienti affetti da cancro del polmone e controlli. È stata eseguita un'analisi dei componenti principali (PCA) senza supervisione per identificare cluster intrinseci e valori anomali all'interno del set di dati. Dopo la rimozione dei valori anomali (rilevati da un grafico dell'intervallo T2 di Hotelling), viene eseguita un'analisi discriminante dei minimi quadrati parziali ortogonali (OPLS-DA), un'estensione dell'analisi discriminante dei minimi quadrati parziali (PLS-DA) con un filtro di correzione del segnale ortogonale integrato. eseguita per rimuovere la variabilità non rilevante per la separazione delle classi. La classificazione prevista è espressa come specificità (la percentuale di controlli che sono effettivamente classificati come controlli) e sensibilità (la percentuale di pazienti con cancro del polmone che sono effettivamente classificati come pazienti con cancro del polmone). Il risultato dell'utilizzo dei valori di integrazione delle regioni spettrali significativamente diverse, ottenuti dal test t di Student con correzione per test multipli di Benjamini-Hochberg, viene confrontato con il risultato in cui sono stati utilizzati i valori di integrazione di tutte le 110 regioni spettrali.