LC-NMR-studie Biomarkers om longkanker op te sporen

Proefpersonen Proefpersonen met longkanker gedetecteerd door een computertomografie (CT)-scan en verwezen naar een positronemissietomografie (PET)/CT-scan zijn inbegrepen. De diagnose longkanker wordt bevestigd door middel van een pathologische biopsie of door een arts gespecialiseerd in oncologie met betrekking tot radiologische of klinische gegevens. De controlegroep bestaat uit proefpersonen die zijn doorverwezen naar de afdeling Nucleaire Geneeskunde voor onderzoek van het hart. Deze controlegroep vertegenwoordigt de gemiddelde populatie, bestaat uit gezonde proefpersonen en patiënten met niet-kankerziekten en heeft geen PET/CT-scan ondergaan. Uitsluitingscriteria zijn als volgt: (1) niet gevast gedurende ten minste 6 uur, (2) slecht gecontroleerde diabetes (nuchtere plasmaglucoseconcentratie ≥ 200 mg/dl) bij kankerpatiënten, (3) medicatie-inname op de dag van bloedafname en (4) behandeling of voorgeschiedenis van kanker in de voorgaande 5 jaar.

Het trainingscohort bestaat uit 80 proefpersonen met longkanker en 80 controles. Het validatiecohort bestaat uit 250 proefpersonen met longkanker en 250 controles.

Bloedafname en verwerking Nuchtere veneuze bloedmonsters (BD Vacutainer® LH 17 I.U. 10 ml tube) worden verzameld en binnen 5 tot 10 minuten bij 4°C bewaard. Circa 8 uur na bloedafname worden bloedmonsters op crushed ijs naar het centrale laboratorium vervoerd en bij kamertemperatuur gecentrifugeerd (swinging bucket centrifuge, 1600 g, 15 minuten). Vervolgens worden 4 plasma aliquots van 500 µl overgebracht in steriele cryoflesjes en bewaard bij -80°C tot onderzoek binnen 6 maanden. Wanneer proefpersonen toestemming geven om hun biologisch materiaal op te slaan, worden 3 aliquots opgeslagen bij de Universitaire Biobank Limburg (UBiLim) voor biomedische onderzoeksdoeleinden.

Voorafgaand aan NMR-analyse worden plasmamonsters ontdooid en gehomogeniseerd met behulp van een vortexmenger. Na centrifugatie bij 13.000 g gedurende 4 minuten bij 4 °C (Eppendorf-centrifuge met vaste rotor 5415 R, Hamburg, Duitsland), worden plasmamonsters verdund in deuteriumoxide (D2O, 99,9%, Cambridge Isotope Laboratories Inc, Andover, VS) met 180 µg /µl trimethylsilyl-2,2,3,3-tetradeuteropropionzuur (TSP, 98%, Cambridge Isotope Laboratories Inc, Andover, VS) als referentie voor chemische verschuivingen. Ten slotte worden de voorbereide plasmamonsters overgebracht naar een NMR-buis van 5 mm en geanalyseerd.

1H-NMR-analyses en toewijzing van aanwezige resonanties De 1H-NMR-spectra worden geregistreerd op een 400 Megahertz (MHz) NMR-spectrometer (Varian/Agilent, Nuclear Magnetic Resonance Instruments, Palo Alto, California, USA) met een magnetische veldsterkte van 9,4 Tesla bij 294 K. Iets T2-gewogen spectra worden verkregen met behulp van een Carr-Purcell-Meiboom-Gill (CPMG) pulssequentie om signalen van macromoleculen, zoals eiwitten en polysacchariden, te verzwakken. Bovendien wordt wateronderdrukking uitgevoerd om een ​​optimale detectie en kwantificering van laagmoleculaire metabolieten mogelijk te maken. De 1H-NMR-spectra worden handmatig gefaseerd, basislijn gecorrigeerd en gerefereerd aan de TSP-resonantie bij 0,015 delen per miljoen (ppm). De toewijzing van de aanwezige 1H-NMR-resonanties gebeurt door middel van spiking-experimenten. Een referentieplasmamonster wordt afwisselend verrijkt met 34 bekende metabolieten met een concentratie van 1 mg verbinding per 100 µl plasma. De verkregen chemische verschuivingen worden dubbel gecontroleerd met Chenomx NMR suite-software (versie 7.5, Chenomx Inc., Edmonton, Alberta, Canada). Ten slotte worden 1H-NMR-spectra verdeeld in 112 spectrale gebieden, die zijn geïntegreerd en genormaliseerd ten opzichte van het totale geïntegreerde gebied van alle spectrale gebieden, ongeacht de resterende water-, TSP-, fructose- en glucoseresonanties. Het eindresultaat komt overeen met 110 genormaliseerde integratieregio's (alle integratieregio's behalve die van water en TSP).

Statistische analyse Eerst worden de integratiewaarden van alle 110 spectrale gebieden geanalyseerd door middel van een student t-test met correctie voor meervoudige testen door Benjamini-Hochberg om die te identificeren die significant verschillen tussen longkankerpatiënten en controles (IBM SPSS versie 20.0, Chicago, Illinois, VS). Ten tweede worden multivariate statistische analyses uitgevoerd met behulp van SIMCA-P+ (versie 12.0, Umetrics, Umea, Zweden) om te onderzoeken of de metabole samenstelling van bloedplasma toelaat om onderscheid te maken tussen longkankerpatiënten en controles. Een hoofdcomponentenanalyse (PCA) zonder toezicht werd uitgevoerd om intrinsieke clusters en uitbijters binnen de dataset te identificeren. Na het verwijderen van uitbijters (gedetecteerd door een T2 range plot van Hotelling), wordt een orthogonale partiële kleinste kwadraten discriminantanalyse (OPLS-DA), een uitbreiding van partiële kleinste kwadraten discriminantanalyse (PLS-DA) met een geïntegreerd orthogonaal signaalcorrectiefilter uitgevoerd. uitgevoerd om variabiliteit te verwijderen die niet relevant is voor klassenscheiding. De voorspelde classificatie wordt uitgedrukt als specificiteit (het percentage controles dat daadwerkelijk wordt geclassificeerd als controles) en sensitiviteit (het percentage longkankerpatiënten dat daadwerkelijk wordt geclassificeerd als longkankerpatiënten). Het resultaat van het gebruik van de integratiewaarden van de significant verschillende spectrale gebieden, verkregen door de student t-test met correctie voor meervoudige testen door Benjamini-Hochberg, wordt vergeleken met het resultaat waarin de integratiewaarden van alle 110 spectrale gebieden werden gebruikt.