LC-NMR-tutkimuksen biomarkkerit keuhkosyövän havaitsemiseksi

Kohteet Mukaan luetaan koehenkilöt, joilla on tietokonetomografialla (CT) havaittu keuhkosyöpä ja jotka on ohjattu positroniemissiotomografiaan (PET)/CT-skannaukseen. Keuhkosyövän diagnoosin vahvistaa patologinen biopsia tai onkologiaan erikoistunut lääkäri radiologisten tai kliinisten tietojen perusteella. Kontrolliryhmä koostuu koehenkilöistä, jotka lähetettiin ydinlääketieteen osastolle sydämen tutkimukseen. Tämä kontrolliryhmä edustaa keskimääräistä väestöä, koostuu terveistä koehenkilöistä ja potilaista, joilla ei ole syöpäsairauksia ja joille ei tehty PET/CT-skannausta. Poissulkemiskriteerit ovat seuraavat: (1) ei paastonnut vähintään 6 tuntia, (2) huonosti hallinnassa oleva diabetes (plasman paastoglukoosipitoisuus ≥ 200 mg/dl) syöpäpotilailla, (3) lääkkeiden saanti verinäytteenottopäivänä ja (4) syövän hoito tai historia edellisen 5 vuoden aikana.

Koulutuskohortissa on 80 keuhkosyöpää sairastavaa henkilöä ja 80 kontrollia. Validointikohortissa on 250 keuhkosyöpää sairastavaa henkilöä ja 250 kontrollia.

Verinäytteenotto ja käsittely Laskimoverinäytteet (BD Vacutainer® LH 17 I.U. 10 ml:n putki) kerätään ja niitä säilytetään 4 °C:ssa 5-10 minuutin kuluessa. Noin 8 tuntia verenoton jälkeen verinäytteet kuljetetaan jäämurskassa keskuslaboratorioon ja sentrifugoidaan huoneenlämpötilassa (swinging bucket sentrifuge, 1600 g, 15 minutes). Sen jälkeen 4 plasman 500 ul:n alikvoottia siirretään steriileihin kryovialeihin ja säilytetään -80 °C:ssa tutkimukseen asti 6 kuukauden sisällä. Kun tutkittavat antavat luvan säilyttää biologista materiaaliaan, 3 alikvoottia säilytetään University Biobank Limburgissa (UBiLim) biolääketieteellistä tutkimusta varten.

Ennen NMR-analyysiä plasmanäytteet sulatetaan ja homogenoidaan käyttämällä vortex-sekoitinta. Sen jälkeen, kun on sentrifugoitu 13 000 g:llä 4 minuuttia 4 °C:ssa (kiinteä roottori Eppendorf-sentrifugi 5415 R, Hampuri, Saksa), plasmaerät laimennetaan deuteriumoksidiin (D2O, 99,9 %, Cambridge Isotope Laboratories Inc, Andover, USA), joka sisältää 180 ug. /µl trimetyylisilyyli-2,2,3,3-tetradeuteropropionihappoa (TSP, 98 %, Cambridge Isotope Laboratories Inc, Andover, USA) kemiallisen siirtymän referenssinä. Lopuksi valmistetut plasmanäytteet siirretään 5 mm:n NMR-putkeen ja analysoidaan.

1H-NMR-analyysit ja nykyisten resonanssien osoittaminen 1H-NMR-spektrit tallennetaan 400 megahertsin (MHz) NMR-spektrometrillä (Varian/Agilent, Nuclear Magnetic Resonance Instruments, Palo Alto, Kalifornia, USA), jonka magneettikentän voimakkuus on 9,4 Teslaa 294 K:ssa. Hieman T2-painotetut spektrit hankitaan käyttämällä Carr-Purcell-Meiboom-Gill (CPMG) -pulssisekvenssiä makromolekyylien, kuten proteiinien ja polysakkaridien, signaalien vaimentamiseksi. Lisäksi suoritetaan veden suppressio pienimolekyylisten metaboliittien optimaalisen havaitsemisen ja kvantifioinnin mahdollistamiseksi. 1H-NMR-spektrit vaiheistetaan manuaalisesti, perusviiva korjataan ja verrataan TSP-resonanssiin 0,015 miljoonasosaa (ppm). Nykyisten 1H-NMR-resonanssien osoittaminen tapahtuu piikkikokeiden avulla. Vertailuplasmanäytteeseen lisätään vuorotellen 34 tunnettua metaboliittia, joiden pitoisuus on 1 mg yhdistettä 100 µl:ssa plasmaa. Saadut kemialliset siirtymät tarkistetaan kahdesti Chenomx NMR -ohjelmistolla (versio 7.5, Chenomx Inc., Edmonton, Alberta, Kanada). Lopuksi 1H-NMR-spektrit on jaettu 112 spektrialueeseen, jotka on integroitu ja normalisoitu suhteessa kaikkien spektrialueiden integroituun kokonaispinta-alaan riippumatta jäljellä olevista vesi-, TSP-, fruktoosi- ja glukoosiresonansseista. Lopputulos vastaa 110 normalisoitua integraatioaluetta (kaikki integraatioalueet paitsi veden ja TSP:n alueet).

Tilastollinen analyysi Aluksi kaikkien 110 spektrialueen integraatioarvot analysoidaan opiskelijan t-testillä, jossa on Benjamini-Hochbergin tekemä monitestien korjaus, jotta voidaan tunnistaa ne, jotka eroavat merkittävästi keuhkosyöpäpotilaiden ja kontrollien välillä (IBM SPSS Version 20.0, Chicago, Illinois, Yhdysvallat). Toiseksi suoritetaan monimuuttujatilastollisia analyyseja SIMCA-P+:lla (versio 12.0, Umetrics, Umea, Ruotsi), jotta voidaan selvittää, mahdollistaako veriplasman metabolisen koostumuksen erottamisen keuhkosyöpäpotilaiden ja kontrollien välillä. Valvomaton pääkomponenttianalyysi (PCA) suoritettiin tunnistaakseen tietojoukon sisäiset klusterit ja poikkeamat. Kun poikkeamat on poistettu (jotka havaitaan Hotellingin T2-aluekaaviolla), suoritetaan ortogonaalinen osittaisten pienimmän neliösumman erotteluanalyysi (OPLS-DA), osittaisten pienimmän neliösumman erotteluanalyysin (PLS-DA) laajennus integroidulla ortogonaalisen signaalin korjaussuodattimella. suoritetaan luokkaerottelun kannalta merkityksettömän vaihtelun poistamiseksi. Ennustettu luokittelu ilmaistaan ​​spesifisyydellä (kontrollien prosenttiosuus, jotka on todella luokiteltu kontrolleiksi) ja herkkyydeksi (prosenttiosuus keuhkosyöpäpotilaista, jotka todella luokitellaan keuhkosyöpäpotilaiksi). Opiskelijan t-testillä saatua merkittävästi erilaisten spektrialueiden integrointiarvojen käyttöä Benjamini-Hochbergin monitestauksen korjauksella verrataan tulokseen, jossa käytettiin kaikkien 110 spektrialueen integraatioarvoja.