LC-NMR Studie biomarkerů k detekci rakoviny plic

Jedinci Jsou zahrnuti jedinci s rakovinou plic detekovanou pomocí počítačové tomografie (CT) a odkazují se na pozitronovou emisní tomografii (PET)/CT. Diagnózu karcinomu plic potvrzuje patologická biopsie nebo lékař se specializací na onkologii s ohledem na radiologická nebo klinická data. Kontrolní skupinu tvoří subjekty, které byly odeslány na oddělení nukleární medicíny k vyšetření srdce. Tato kontrolní skupina představuje průměrnou populaci, skládá se ze zdravých subjektů a pacientů s nerakovinným onemocněním a nepodstoupila PET/CT sken. Kritéria vyloučení jsou následující: (1) nelačno alespoň 6 hodin, (2) špatně kontrolovaný diabetes (koncentrace glukózy v plazmě nalačno ≥ 200 mg/dl) u pacientů s rakovinou, (3) příjem léků v den odběru krve a (4) léčba nebo anamnéza rakoviny v předchozích 5 letech.

Tréninková kohorta se skládá z 80 subjektů s rakovinou plic a 80 kontrol. Validační kohortu tvoří 250 subjektů s rakovinou plic a 250 kontrol.

Odběr a zpracování krve Vzorky žilní krve na lačno (zkumavka BD Vacutainer® LH 17 I.U. 10 ml) se odeberou a uloží při 4 °C během 5 až 10 minut. Přibližně 8 hodin po odběru krve jsou vzorky krve transportovány na drceném ledu do centrální laboratoře a centrifugovány při pokojové teplotě (kyvná kyblíková centrifuga, 1600 g, 15 minut). Následně se 4 alikvoty plazmy po 500 ul přenesou do sterilních kryozkumavek a skladují se při -80 °C do vyšetření během 6 měsíců. Když subjekty povolí skladovat svůj biologický materiál, jsou 3 alikvoty uloženy v University Biobank Limburg (UBiLim) pro účely biomedicínského výzkumu.

Před NMR analýzou se alikvoty plazmy rozmrazí a homogenizují za použití vortexového mixéru. Po odstředění při 13 000 g po dobu 4 minut při 4 °C (centrifúga Eppendorf s pevným rotorem 5415 R, Hamburg, Německo) se alikvoty plazmy zředí oxidem deuteria (D2O, 99,9 %, Cambridge Isotope Laboratories Inc, Andover, USA) obsahujícím 180 ug /ul kyseliny trimethylsilyl-2,2,3,3-tetradeuteropropionové (TSP, 98%, Cambridge Isotope Laboratories Inc, Andover, USA) jako referenční chemický posun. Nakonec jsou připravené vzorky plazmy přeneseny do 5 mm NMR zkumavky a analyzovány.

1H-NMR analýzy a přiřazení přítomných rezonancí 1H-NMR spektra se zaznamenávají na 400 Megahertz (MHz) NMR spektrometru (Varian/Agilent, Nuclear Magnetic Resonance Instruments, Palo Alto, Kalifornie, USA) se silou magnetického pole 9,4 Tesla při 294 K. Mírně T2-vážená spektra se získají pomocí Carr-Purcell-Meiboom-Gill (CPMG) pulzní sekvence pro zeslabení signálů makromolekul, jako jsou proteiny a polysacharidy. Kromě toho se provádí potlačení vody, aby se umožnila optimální detekce a kvantifikace nízkomolekulárních metabolitů. 'H-NMR spektra jsou fázována manuálně, korigována na základní linii a vztažena k TSP rezonanci při 0,015 částice na milion (ppm). Přiřazení současných 'H-NMR rezonancí se provádí pomocí experimentů s nástřikem. K referenčnímu vzorku plazmy se střídavě přidává 34 známých metabolitů s koncentrací 1 mg sloučeniny na 100 ul plazmy. Získané chemické posuny se dvakrát zkontrolují pomocí softwaru Chenomx NMR suite (verze 7.5, Chenomx Inc., Edmonton, Alberta, Kanada). Nakonec jsou 1H-NMR spektra rozdělena do 112 spektrálních oblastí, které jsou integrovány a normalizovány vzhledem k celkové integrované ploše všech spektrálních oblastí, bez ohledu na rezonanci zbývající vody, TSP, fruktózy a glukózy. Konečný výsledek odpovídá 110 normalizovaným integračním oblastem (všechny integrační oblasti kromě oblastí vody a TSP).

Statistická analýza Nejprve se analyzují integrační hodnoty všech 110 spektrálních oblastí pomocí studentského t-testu s korekcí na vícenásobné testování Benjamini-Hochbergem, aby se identifikovaly ty, které se významně liší mezi pacienty s rakovinou plic a kontrolami (IBM SPSS verze 20.0, Chicago, Illinois, USA). Za druhé se provádějí vícerozměrné statistické analýzy pomocí SIMCA-P+ (verze 12.0, Umetrics, Umea, Švédsko), aby se zjistilo, zda metabolické složení krevní plazmy umožňuje rozlišovat mezi pacienty s rakovinou plic a kontrolami. K identifikaci vnitřních shluků a odlehlých hodnot v rámci datové sady byla provedena analýza hlavních komponent bez dozoru (PCA). Po odstranění odlehlých hodnot (detekovaných Hotellingovým grafem rozsahu T2) je provedena ortogonální částečná diskriminační analýza nejmenších čtverců (OPLS-DA), rozšíření částečné diskriminační analýzy nejmenších čtverců (PLS-DA) s integrovaným filtrem korekce ortogonálního signálu. provedené k odstranění variability, která není relevantní pro oddělení tříd. Předpokládaná klasifikace je vyjádřena jako specificita (procento kontrol, které jsou skutečně klasifikovány jako kontroly) a senzitivita (procento pacientů s rakovinou plic, kteří jsou skutečně klasifikováni jako pacienti s rakovinou plic). Výsledek použití integračních hodnot významně odlišných spektrálních oblastí, získaný Studentským t-testem s korekcí pro vícenásobné testování Benjamini-Hochbergem, je porovnán s výsledkem, ve kterém byly použity integrační hodnoty všech 110 spektrálních oblastí.