희귀 질환에서 보완 진단 도구로 RNA-Seq를 사용하기 위한 파이프라인 개발 (ANTHEM)

희귀 유전 질환은 매우 이질적인 질병군으로, 종종 진단되지 않고 환자가 대증 치료만 받습니다. 차세대 대량 시퀀싱 기술(Next-Generation-Sequencing, NGS)의 개발로 이러한 병리를 담당하는 많은 유전자를 식별할 수 있게 되었으며, 이를 통해 병원성 메커니즘을 설명할 수 있습니다. 엑솜 시퀀싱(Whole-Exome Sequencing; WES) 또는 게놈 시퀀싱(Whole-Genome Sequencing; WGS)과 같이 가장 일반적으로 사용되는 방법은 DNA 시퀀싱을 기반으로 하며 다음과 같은 단백질 기능의 손실을 유발하는 병원성 돌연변이를 식별할 수 있습니다. 정지 돌연변이, 대규모 삽입 및 삭제, 표준 스플라이싱 부위의 손실. 반대로, 아미노산 치환 변이체(미스센스) 또는 동의어 변이체에 대한 병원성의 속성은 종종 의심스럽기 때문에 이러한 변이체는 종종 의미를 알 수 없는 변이체(VUS)로 분류됩니다. 또한, 엑솜 시퀀싱은 비정규 스플라이스 부위 또는 깊은 인트론 변이와 같은 비암호화 영역에 있는 가능한 병원성 변이를 식별할 수 없습니다.

WGS 시퀀싱은 유전자의 비암호화 영역에 존재하는 변이체를 식별할 수 있게 해주지만 매우 비싸고 낮은 병원성 정보로 엄청난 양의 데이터를 생성합니다. 인트론 변이체의 가능한 병원성을 분석하는 알고리즘은 예측력이 거의 없으며 식별된 변이체의 병원성은 길고 복잡한 기능 분석을 통해 검증되어야 합니다. 이러한 한계로 인해 희귀 유전 질환 환자의 약 50%가 진단되지 않은 상태로 남아 맞춤 의학의 혜택을 받을 수 없습니다. Transcriptome sequencing(RNA-Seq)은 RNA의 서열과 수준의 변이를 결정할 수 있게 하여 WES 및 WGS로 얻은 정보에 보완적인 정보를 제공하여 유전자 진단의 효율성을 향상시킵니다. 유전병의 주요 원인 중 하나인 스플라이싱 변이는 심부 인트론 영역과 코딩 영역 모두에 상주할 수 있으며 RNA 시퀀싱을 통해 확인할 수 있습니다. RNA 발현 수준에 영향을 미칠 수 있는 유전자 조절 영역의 변이체도 RNA-Seq에 의해 강조 표시될 수 있습니다. 선택적 스플라이싱에 의해 생성된 수준 및 이소형 측면에서 RNA 발현은 조직 특이적이기 때문에 가장 전사적으로 유익한 생물학적 물질은 확실히 영향을 받은 조직입니다. 그러나 이것이 항상 달성하기 쉬운 것은 아니며 수집이 환자에게 너무 침습적일 수 있습니다. 이러한 경우 낮은 침습성과 광범위한 RNA 발현 프로파일을 갖는 전혈 또는 피부 생검과 같은 대체 조직의 사용에 의지할 수 있습니다. 특히 피부 생검에서 얻은 섬유아세포는 광범위한 병리학에서 RNA-Seq 분석을 위한 가장 신뢰할 수 있고 균일하며 유익한 대체 매트릭스임이 입증되었습니다. Yépez와 동료들은 피부 섬유아세포의 RNA-Seq에서 얻은 정보가 혈액에서 얻은 정보보다 우수함을 입증했습니다. 또한, 피부 섬유아세포의 전사체 분석을 통해 신경근 및 신경발달 질환에서 변화된 수준의 전사체 및 스플라이싱 이상을 식별할 수 있었습니다. 이를 통해 WES 및 WGS 음성 환자의 유전적 병리 진단에서 피부 섬유아세포 사용의 효능을 확인했습니다. 마지막으로, 피부 섬유아세포는 가능한 향후 분석을 위해 다른 세포 유형으로 재프로그래밍될 수 있습니다.

이 프로젝트는 RNA-Seq 기술을 통해 조기 발병 및 음성 WES를 보이는 소아 및 성인 환자에서 진단되지 않은 희귀 질환의 기저에 있는 유전적 변이를 식별하는 것을 목표로 합니다.

NGS는 유전질환 진단에 필수적이지만 성공률은 30~50%에 이른다. RNA-Seq의 등장으로 유전질환 진단 확률이 8%에서 36%로 높아졌다. 이 프로젝트를 통해 우리는 WES 분석의 통합으로 RNA-Seq 방법을 희귀 유전병 진단에 적용하려고 합니다.

• 목표 1: 기술을 설정하고 검증합니다. 건강한 피험자와 알려진 스플라이싱 변경 및/또는 변경된 RNA 발현이 있는 환자에서 전사체 분석 프로토콜의 설정 및 검증.
• 목표 2: 진단 단계. 희귀 유전병 및 음성 엑솜 환자의 피부 생검에서 얻은 배양 섬유아세포의 스플라이싱 변경 및 RNA 수준 연구.

탐색적 목표.

• 피부 생검 유래 섬유아세포에서 얻은 RNA 발현 프로필을 혈액의 RNA 발현 프로필과 비교합니다. 가장 관련성이 높은 결과는 qRT-PCR에서 검증됩니다.
• 등록된 피험자의 피부 유래 섬유아세포에서 전사 및 단백질 프로필 이질성을 분석합니다.

참가자의 혈장 및 혈청에서 유전자(WES에서) 및 전사(RNA-seq에서) 변경의 영향을 탐색합니다.

건강한 컨트롤. Mario Negri Institute for Pharmacological Research 직원 중에서 5명의 건강한 피험자를 모집합니다. 건강한 지원자 범주를 보호하기 위해 등록은 ​​Daccò 센터의 보건 담당자에게 위임되며 이메일을 통해 연구소의 모든 직원에게 자발적으로 연구에 참여할 가능성을 알릴 것입니다. . 관리자나 튜터는 자원봉사자 모집에 관여하지 않습니다. 기밀성을 추가로 보장하기 위해 연구 목적을 위해 건강한 지원자의 샘플은 코드화된 형태로 처리됩니다. 코드화된 샘플은 피부 섬유아세포 및 RNA-Seq의 분리 및 배양 방법을 설정하는 데 사용됩니다.

유효성 검사 그룹. 피부 섬유아세포 분리 및 RNA-Seq 절차의 설정 및 검증을 위해 진단이 알려져 있고 RNA 수준 및/또는 스플라이싱이 변경된 10명의 성인 환자를 양성 대조군으로 모집합니다.

이 중 비정형 용혈-요독 증후군(aHUS), 막증식성 사구체신염(MPGN), 상염색체 우성 다낭성 신장(ADPKD) 또는 이전에 다코 센터에서 진단받은 기타 희귀 병리를 앓고 있는 환자가 포함되며, 이들은 수집 및 인증된 바이오뱅크(Mario Negri Biological Resources Center - Rare and Kidney Diseases Biobank)의 샘플 보존(2016년 이후 UNI EN ISO 9001, 인증 번호 6121). 위에서 설명한 요구 사항을 충족하는 환자는 프로젝트를 설명하는 인터뷰를 위해 Daccò Center의 의사로부터 연락을 받을 것입니다. 연구 참여에 동의하는 사람은 실험 부분을 진행하기 전에 정보에 입각한 동의서에 서명해야 합니다.

"발견/탐색" 그룹. 탐색 코호트는 Mario Negri Institute for Pharmacological Research의 임상 센터에 속하고 WES 조사에서 원인이 되는 유전적 변이를 밝히지 않은 유전 질환이 의심되는(유아 발병이 있는 어린이 및 성인) 진단되지 않은 증상이 있는 30명의 환자로 구성됩니다. 이를 위해 우리는 약 60명의 환자, 그들의 부모 및 가능한 경우 더 유익한 가족 구성원을 모집할 계획이며, 이전에 수행하지 않은 경우 WES에서 분석할 것입니다. 문헌과 경험을 바탕으로 WES 분석이 사례의 40-50%에서 치유될 것으로 예상합니다(Lunke et al., 2023). 따라서 WES가 음성인 30명의 환자를 식별하여 "발견/탐색" 코호트에 들어갈 수 있다고 가정합니다.

인증된 바이오뱅크(Mario Negri Biological Resources Center - Rare and Renal Diseases Biobank)에서 샘플 수집 및 보관(2016년 이후 UNI EN ISO 9001, 인증 번호 6121)에 대한 동의서에 서명한 후 임상 정보 수집 후, 환자가 프로젝트에 등록됩니다.

DNA 및 섬유아세포 분리를 위한 혈액 및 피부 생검 샘플은 아래에 설명된 대로 수집됩니다.

WES 분석을 위해 성인은 EDTA 전혈 3ml 튜브 3개를, 어린이는 EDTA 전혈 3ml 튜브 2개를 채취하여 사용할 때까지 -20°C에서 보관합니다. 혈액 수집은 Mario Negri Institute-Daccò Center에서 수행됩니다.

WES 분석은 희귀 질환 임상 연구 센터 "Aldo e Cele Daccò" 또는 당사 책임 하에 선정된 특수 외부 실험실에서 수행됩니다.

탐색적 분석을 위해 전혈 3mL를 추가로 TempusTM Blood RNA 튜브에 채취합니다.

혈액, 혈청 및 혈장 형태의 생물학적 물질을 포함하는 연구용 바이오뱅크가 "Mario Negri Biological Resource Center - Rare Diseases and Kidney Diseases Biobank"에 설립됩니다.

첫 번째 방문에서 환자는 추가 연구를 위해 향후 샘플을 사용할 수 있는 능력을 포함하여 연구 바이오뱅크 참여에 관한 특정 정보 및 선택 사항이 포함된 연구별 동의서에 서명합니다.

피험자가 동의하면 혈청 및 혈장 분취량(혈장 1 x 2ml, 혈청 1 x 2ml)을 수집하여 코딩된 형태로 바이오뱅크에 보관합니다.