Utvikle en pipeline for å bruke RNA-Seq som et komplementært diagnostisk verktøy ved sjeldne sykdommer (ANTHEM)

Sjeldne genetiske sykdommer er en svært heterogen gruppe sykdommer, ofte udiagnostiserte, som pasienter kun får symptomatisk behandling for. Utviklingen av neste generasjons massiv sekvenseringsteknologi (Next-Generation-Sequencing; NGS) har gjort det mulig å identifisere mange av genene som er ansvarlige for disse patologiene, slik at de patogene mekanismene kan skisseres. De mest brukte metodene, som exome-sekvensering (Whole-Exome Sequencing; WES) eller genomsekvensering (Whole-Genome Sequencing; WGS), er basert på DNA-sekvensering og gjør det mulig å identifisere patogene mutasjoner som forårsaker tap av proteinfunksjonalitet, som f.eks. stopp mutasjoner, store innsettinger og slettinger og tap av kanoniske spleisesteder. Motsatt er tilskrivningen av patogenisitet til en aminosyresubstitusjonsvariant (missense) eller en synonym variant ofte tvilsom, og følgelig blir slike varianter ofte kategorisert som varianter av ukjent betydning (VUS). Videre er eksomsekvensering ikke i stand til å identifisere mulige patogene varianter lokalisert i ikke-kodende regioner, for eksempel ikke-kanoniske spleisesteder eller dype introniske varianter.

WGS-sekvensering, mens det tillater identifisering av varianter som er tilstede i de ikke-kodende regionene til et gen, er svært kostbart og produserer en enorm mengde data med lav patogen informasjon. Algoritmer for å analysere den mulige patogenisiteten til introniske varianter har liten prediktiv kraft, og patogenisiteten til de identifiserte variantene må valideres ved lange og komplekse funksjonelle analyser. På grunn av disse begrensningene forblir omtrent 50 % av pasientene med sjeldne genetiske sykdommer udiagnostisert og kan ikke dra nytte av fordelene med personlig medisin. Transkriptomsekvensering (RNA-Seq) gjør det mulig å bestemme variasjoner i sekvensen og nivåene av RNA, og gir komplementær informasjon til den som oppnås med WES og WGS, og forbedrer dermed effektiviteten av genetisk diagnose. Skjøteendringer, som er blant hovedårsakene til genetiske sykdommer og kan ligge både i dype introniske regioner og i kodende regioner, kan identifiseres gjennom RNA-sekvensering. Varianter i de regulatoriske områdene av genet, som er i stand til å påvirke RNA-ekspresjonsnivåer, kan også fremheves av RNA-Seq. Siden RNA-ekspresjon, når det gjelder nivåer og isoformer produsert ved alternativ spleising, er vevsspesifikk, er det mest transkripsjonelt informative biologiske materialet absolutt det berørte vevet. Dette er imidlertid ikke alltid lett å få til og samlingen kan bli for invasiv for pasienten. I disse tilfellene er det mulig å ty til bruk av alternative vev, som helblod eller hudbiopsier, som har lav invasivitet og en bred RNA-ekspresjonsprofil. Spesielt fibroblaster hentet fra hudbiopsier har vist seg å være den mest pålitelige, homogene og informative alternative matrisen for RNA-Seq-analyse, i et bredt spekter av patologier. Yépez og medarbeidere demonstrerte at informasjonen som ble hentet fra RNA-Seq fra hudfibroblaster var overlegen den som ble oppnådd fra blod. Videre tillot analysen av transkriptomet til hudfibroblaster å identifisere endrede nivåer av transkripsjoner og spleiseavvik ved nevromuskulære og nevroutviklingssykdommer. Dette bekreftet effekten av bruk av hudfibroblaster i diagnostisering av genetiske patologier hos WES- og WGS-negative pasienter. Sist men ikke minst kan hudfibroblaster omprogrammeres til andre celletyper for mulige fremtidige analyser.

Dette prosjektet har som mål å identifisere, gjennom RNA-Seq-teknologi, de genetiske endringene som ligger til grunn for udiagnostiserte sjeldne sykdommer hos pediatriske og voksne pasienter med tidlig debut og med negativ WES.

Selv om NGS er avgjørende for diagnostisering av genetiske sykdommer, varierer suksessraten fra 30 % til 50 %. Fremkomsten av RNA-Seq økte sjansen for å diagnostisere genetiske sykdommer fra 8 % til 36 %. Gjennom dette prosjektet har vi til hensikt å anvende RNA-Seq-metoden, som en integrasjon av WES-analysen, for diagnostisering av sjeldne genetiske sykdommer:

• Mål 1: Sette opp og validere teknikker. Oppsett og validering av transkriptomanalyseprotokollen hos friske personer og hos pasienter med kjente spleiseendringer og/eller endret RNA-ekspresjon.
• Mål 2: Diagnostisk fase. Studie av spleiseendringer og RNA-nivåer i dyrkede fibroblaster hentet fra hudbiopsier av pasienter med sjeldne genetiske sykdommer og negativt eksom.

Utforskende mål.

• Sammenlign RNA-ekspresjonsprofilen oppnådd fra hudbiopsi-avledede fibroblaster med RNA-ekspresjonsprofilen fra blod. De mest relevante resultatene vil bli validert i qRT-PCR.
• Å analysere transkripsjons- og proteinprofilens heterogenitet i hudavledede fibroblaster hos påmeldte personer.

Å utforske effekten av genetiske (fra WES) og transkripsjonelle (fra RNA-seq) endringer i deltakernes plasma og serum.

Sunne kontroller. Fem friske forsøkspersoner vil bli rekruttert fra ansatte ved Mario Negri Institute for Pharmacological Research. For å sikre beskyttelsen av kategorien friske frivillige, har det vært forestilt at påmeldingen blir overlatt til helsepersonellet ved Daccò-senteret, som vil informere alle ansatte ved instituttet via e-post om muligheten for spontant å delta i studien . Ingen leder eller veileder vil være involvert i rekruttering av frivillige. Som en ytterligere garanti for konfidensialitet, for formålet med studien, vil prøvene fra friske frivillige bli behandlet i kodet form. De kodede prøvene vil bli brukt til å sette opp metoden for isolering og dyrking av hudfibroblaster og RNA-Seq.

Valideringsgruppe. For oppsett og validering av hudfibroblastisolering og RNA-Seq-prosedyre vil ti voksne pasienter med kjent diagnose og med endringer i RNA-nivåer og/eller spleising rekrutteres som positive kontroller.

Blant disse vil pasienter som er rammet av atypisk hemolytisk-uremisk syndrom (aHUS), membranoproliferativ glomerulonefritt (MPGN), autosomal dominant polycystisk nyre (ADPKD) eller andre sjeldne patologier som tidligere er diagnostisert ved Daccò-senteret, inkluderes, som har gitt sitt samtykke til innsamlingen og konservering (UNI EN ISO 9001 siden 2016; sertifiseringsnr. 6121) av prøvene i den sertifiserte biobanken (Mario Negri Biological Resources Centre - Rare and Kidney Diseases Biobank). Pasienter som oppfyller kravene beskrevet ovenfor, vil bli kontaktet av legene ved Daccò-senteret for et intervju som forklarer prosjektet. De som godtar å delta i studien vil bli bedt om å signere det informerte samtykket før de fortsetter med den eksperimentelle delen.

"Oppdagelse/Utforsking"-gruppe. Utforskningskohorten vil bestå av 30 symptomatiske udiagnostiserte pasienter med mistenkt genetisk sykdom (barn og voksne med infantil debut) som tilhører det kliniske senteret til Mario Negri Institute for Pharmacological Research og for hvem WES-undersøkelser ikke avslørte forårsakende genetiske endringer. For dette formål planlegger vi å rekruttere rundt 60 pasienter, deres foreldre og mer informative familiemedlemmer, hvis tilgjengelig, som vil bli analysert, hvis ikke gjort tidligere, av WES. Basert på litteraturen og vår erfaring forventer vi at WES-analyse vil være kurativ i 40-50 % av tilfellene (Lunke et al., 2023). Derfor antar vi å identifisere 30 pasienter med negativ WES og som derfor vil kunne gå inn i "Discovery/Exploration"-kohorten.

Etter å ha signert det informerte samtykket til innsamling og lagring av prøver (UNI EN ISO 9001 siden 2016; sertifiseringsnr. 6121) i den sertifiserte biobanken (Mario Negri Biological Resources Center - Rare and Renal Diseases Biobank) og etter innsamling av klinisk informasjon, pasienter vil bli registrert i prosjektet.

Blod- og hudbiopsiprøver for DNA- og fibroblastisolering vil bli samlet inn som beskrevet nedenfor.

For WES-analysene vil 3 rør med 3 ml fullblod i EDTA tas fra voksne og 2 rør med 3 ml fullblod i EDTA fra barn og oppbevares ved -20°C frem til bruk. Blodinnsamling vil bli gjort ved Mario Negri Institute-Daccò Center.

WES-analysene vil bli utført ved Clinical Research Center for Rare Diseases "Aldo e Cele Daccò" eller i et spesialisert eksternt laboratorium, valgt under vårt ansvar.

En ekstra 3 mL aliquot av fullblod vil bli trukket inn i TempusTM Blood RNA-rør, for utforskende analyse.

En forskningsbiobank som inneholder biologisk materiale i form av blod, serum og plasma vil bli opprettet ved «Mario Negri Biologisk Ressurssenter - Biobank for sjeldne sykdommer og nyresykdommer».

Ved første besøk vil pasientene signere et studiespesifikt samtykkeskjema, som inneholder spesifikk informasjon og valg angående deltakelse i forskningsbiobanken, inkludert muligheten til å bruke prøvene i fremtiden til ytterligere forskningsstudier.

Hvis forsøkspersonene gir sitt samtykke, vil alikvoter av serum og plasma (1 x 2 ml plasma, 1 x 2 ml serum) samles inn og lagres i kodet form i biobanken.