希少疾患の補完的診断ツールとして RNA-Seq を採用するパイプラインを開発 (ANTHEM)

希少遺伝性疾患は非常に多様な疾患群であり、多くの場合診断されておらず、患者は対症療法のみを受けています。 次世代大規模配列決定技術 (Next-Generation-Sequencing; NGS) の開発により、これらの病状の原因となる遺伝子の多くが同定され、病因メカニズムの概要が明らかになりました。 エクソームシーケンス (全エキソームシーケンス; WES) やゲノムシーケンス (全ゲノムシーケンス; WGS) などの最も一般的に使用される方法は、DNA シーケンスに基づいており、タンパク質の機能の喪失を引き起こす病原性変異を特定できます。突然変異、大きな挿入や欠失、標準的なスプライシング部位の喪失を阻止します。 逆に、アミノ酸置換変異体 (ミスセンス) または同義変異体による病原性の帰属には疑問が残ることが多く、そのため、そのような変異体は重要性不明変異体 (VUS) として分類されることがよくあります。 さらに、エクソームシーケンスでは、非標準スプライス部位やディープイントロンバリアントなど、非コード領域に位置する可能性のある病原性バリアントを特定することはできません。

WGS シークエンシングは、遺伝子の非コード領域に存在する変異体の同定を可能にしますが、非常に高価であり、病原性情報が低い膨大な量のデータを生成します。 イントロン変異の病原性の可能性を分析するアルゴリズムには予測力がほとんどなく、特定された変異の病原性は、長く複雑な機能分析によって検証する必要があります。 これらの制限により、希少遺伝性疾患患者の約 50% は未診断のままであり、個別化医療の恩恵を受けることができません。 トランスクリプトーム シークエンシング (RNA-Seq) を使用すると、RNA の配列とレベルの変動を決定することができ、WES や WGS で得られる情報に相補的な情報が提供されるため、遺伝子診断の効率が向上します。 スプライシングの変化は、遺伝病の主な原因の 1 つであり、深部イントロン領域とコーディング領域の両方に存在する可能性があり、RNA シーケンスによって特定できます。 RNA 発現レベルに影響を与える可能性がある遺伝子の調節領域の変異も、RNA-Seq によって強調表示できます。 選択的スプライシングによって生成されるレベルおよびアイソフォームの観点から見た RNA 発現は組織特異的であるため、転写に関して最も有益な生体物質は影響を受けた組織であることは間違いありません。 しかし、これは必ずしも簡単に達成できるわけではなく、収集は患者にとって侵襲的すぎる場合があります。 このような場合、侵襲性が低く、幅広い RNA 発現プロファイルを持つ全血や皮膚生検などの代替組織の使用に頼ることができます。 特に皮膚生検から得られた線維芽細胞は、幅広い病状における RNA-Seq 解析のための最も信頼性が高く、均質で有益な代替マトリックスであることが証明されています。 Yépez氏と共同研究者らは、皮膚線維芽細胞のRNA-Seqから得られる情報が血液から得られる情報よりも優れていることを実証した。 さらに、皮膚線維芽細胞のトランスクリプトームの分析により、神経筋疾患および神経発達疾患における転写レベルの変化とスプライシング異常を特定することができました。 これにより、WES および WGS 陰性患者の遺伝的病状の診断における皮膚線維芽細胞の使用の有効性が確認されました。 最後になりましたが、皮膚線維芽細胞は、将来の分析に備えて他の細胞型に再プログラムすることができます。

このプロジェクトは、RNA-Seq 技術を通じて、早期発症で WES 陰性の小児および成人患者における未診断の希少疾患の根底にある遺伝子変異を特定することを目的としています。

NGS は遺伝病の診断に不可欠ですが、その成功率は 30% ～ 50% です。 RNA-Seq の出現により、遺伝性疾患を診断できる確率は 8% から 36% に増加しました。 このプロジェクトを通じて、我々は、WES 解析の統合として RNA-Seq 法を希少な遺伝性疾患の診断に適用する予定です。

• 目標 1: テクニックを設定して検証する。 健康な被験者および既知のスプライシング変化および/または RNA 発現変化のある患者におけるトランスクリプトーム解析プロトコルのセットアップと検証。
• 目標 2: 診断段階。 希少遺伝性疾患およびネガティブエクソームを有する患者の皮膚生検から得られた培養線維芽細胞におけるスプライシングの変化とRNAレベルの研究。

探索的な目標。

• 皮膚生検由来の線維芽細胞から得られた RNA 発現プロファイルを血液からの RNA 発現プロファイルと比較します。 最も関連性の高い結果は qRT-PCR で検証されます。
• 登録された被験者の皮膚由来線維芽細胞における転写およびタンパク質プロファイルの不均一性を分析するため。

参加者の血漿および血清における遺伝的 (WES による) および転写 (RNA-seq による) 変化の影響を調査する。

健全なコントロール。 マリオ・ネグリ薬理学研究所のスタッフから5人の健康な被験者が募集されます。 健康なボランティアのカテゴリーを確実に保護するために、登録はダッコセンターの医療担当者に委託され、同センターの医療担当者が自発的に研究に参加できる可能性を研究所の全スタッフに電子メールで通知することが想定されている。 。 ボランティアの募集にはマネージャーや講師は関与しません。 機密性のさらなる保証として、研究の目的のために、健康なボランティアのサンプルはコード化された形式で処理されます。コード化されたサンプルは、皮膚線維芽細胞およびRNA-Seqの単離および培養方法を設定するために使用されます。

検証グループ。 皮膚線維芽細胞の単離とRNA-Seq手順の設定と検証のために、診断が判明し、RNAレベルおよび/またはスプライシングに変化がある10人の成人患者が陽性対照として募集される。

この中には、非定型溶血性尿毒症症候群（aHUS）、膜性増殖性糸球体腎炎（MPGN）、常染色体優性多発性嚢胞腎（ADPKD）、またはダッコセンターで以前に診断されたその他の稀な病状に罹患し、収集および収集に同意した患者も含まれます。認定されたバイオバンク（マリオ・ネグリ生物資源センター - 希少疾患および腎臓疾患バイオバンク）内のサンプルの保存（2016 年以降 UNI EN ISO 9001、認証番号 6121）。 上記の要件を満たす患者には、ダッコセンターの医師から連絡があり、プロジェクトについて説明する面接を受けます。 研究に参加することに同意した人は、実験部分に進む前にインフォームドコンセントに署名するよう求められます。

「発見・探検」グループ。 この探索コホートは、マリオ・ネグリ薬理学研究所の臨床センターに所属し、WES調査では原因となる遺伝子変異が明らかにされなかった、遺伝性疾患が疑われる症候性の未診断患者30人（小児および成人で乳児期発症）で構成される。 この目的を達成するために、私たちは約 60 人の患者、その両親、および可能であればより多くの情報を提供してくれる家族を募集し、これまでに分析されていない場合は WES によって分析される予定です。 文献と私たちの経験に基づいて、WES分析は症例の40〜50％で治癒すると期待しています（Lunke et al.、2023）。 したがって、WES 陰性の 30 人の患者を特定し、その結果、「発見/探索」コホートに参加できると仮定します。

認定バイオバンク (マリオ・ネグリ生物資源センター - 希少腎疾患バイオバンク) でのサンプルの収集と保管に対するインフォームド・コンセント (2016 年以降 UNI EN ISO 9001、認証番号 6121) に署名し、臨床情報を収集した後、患者はプロジェクトに登録されます。

DNA および線維芽細胞の単離のための血液および皮膚の生検サンプルは、以下に説明するように収集されます。

WES分析では、成人からEDTA中の全血3mlのチューブ3本を採取し、小児からEDTA中の全血3mlのチューブ2本を採取し、使用するまで-20℃で保存する。 採血はマリオ・ネグリ研究所・ダッコセンターで行われます。

WES 分析は、希少疾患臨床研究センター「Aldo e Cele Daccò」、または当社の責任で選択された外部の専門研究所で実施されます。

探索的分析のために、全血の追加の 3 mL アリコートが TempusTM Blood RNA チューブに採取されます。

血液、血清、血漿の形態の生物学的物質を含む研究用バイオバンクが「マリオ・ネグリ生物資源センター - 希少疾患および腎臓疾患バイオバンク」に設立される。

最初の訪問時に、患者は研究固有の同意書に署名します。この同意書には、将来追加の研究研究にサンプルを使用する能力など、研究バイオバンクへの参加に関する特定の情報と選択肢が記載されています。

被験者が同意した場合、血清と血漿のアリコート（血漿 2 ml x 1、血清 2 ml x 1）が収集され、コード化された形式でバイオバンクに保存されます。