Udvikling af en pipeline til at anvende RNA-Seq som et komplementært diagnostisk værktøj ved sjældne sygdomme (ANTHEM)

Sjældne genetiske sygdomme er en meget heterogen gruppe af sygdomme, ofte udiagnosticerede, som patienter kun får symptomatisk behandling for. Udviklingen af ​​næste generations massiv sekventeringsteknologi (Next-Generation-Sequencing; NGS) har gjort det muligt at identificere mange af de gener, der er ansvarlige for disse patologier, hvilket gør det muligt at skitsere de patogene mekanismer. De mest almindeligt anvendte metoder, såsom exome-sekventering (Whole-Exome Sequencing; WES) eller genom-sekventering (Whole-Genome Sequencing; WGS), er baseret på DNA-sekventering og gør det muligt at identificere patogene mutationer, der forårsager tab af proteinfunktionalitet, som f.eks. stop mutationer, store insertioner og deletioner og tab af kanoniske splejsningssteder. Omvendt er tilskrivningen af ​​patogenicitet til en aminosyresubstitutionsvariant (missense) eller en synonym variant ofte tvivlsom, og følgelig kategoriseres sådanne varianter ofte som Varianter af ukendt betydning (VUS). Ydermere er exome-sekventering ikke i stand til at identificere mulige patogene varianter placeret i ikke-kodende regioner, såsom ikke-kanoniske splejsningssteder eller dybe introniske varianter.

WGS-sekventering, mens det tillader identifikation af varianter, der er til stede i de ikke-kodende regioner af et gen, er meget dyrt og producerer en enorm mængde data med lav patogen information. Algoritmer til at analysere den mulige patogenicitet af introniske varianter har ringe forudsigelsesevne, og patogeniciteten af ​​de identificerede varianter skal valideres ved lange og komplekse funktionelle analyser. På grund af disse begrænsninger forbliver cirka 50 % af patienter med sjældne genetiske sygdomme udiagnosticerede og kan ikke drage fordel af fordelene ved personlig medicin. Transkriptom-sekventering (RNA-Seq) gør det muligt at bestemme variationer i sekvensen og niveauerne af RNA, hvilket giver komplementær information til den, der opnås med WES og WGS, og dermed forbedre effektiviteten af ​​genetisk diagnose. Splejsningsændringer, som er blandt hovedårsagerne til genetiske sygdomme og kan findes både i dybe introniske regioner og i kodende regioner, kan identificeres gennem RNA-sekventering. Varianter i genets regulatoriske regioner, som er i stand til at påvirke RNA-ekspressionsniveauer, kan også fremhæves af RNA-Seq. Da RNA-ekspression, hvad angår niveauer og isoformer produceret ved alternativ splejsning, er vævsspecifik, er det mest transkriptionelt informative biologiske materiale bestemt det berørte væv. Dette er dog ikke altid let at opnå, og samlingen kan være for invasiv for patienten. I disse tilfælde er det muligt at ty til brugen af ​​alternative væv, såsom fuldblod eller hudbiopsier, som har lav invasivitet og en bred RNA-ekspressionsprofil. Især fibroblaster opnået fra hudbiopsier har vist sig at være den mest pålidelige, homogene og informative alternative matrix til RNA-Seq-analyse inden for en lang række patologier. Yépez og samarbejdspartnere påviste, at informationen opnået fra RNA-Seq fra hudfibroblaster var bedre end den, der blev opnået fra blod. Desuden tillod analysen af ​​transkriptomet af hudfibroblaster at identificere ændrede niveauer af transkripter og splejsningsabnormiteter i neuromuskulære og neuro-udviklingssygdomme. Dette bekræftede effektiviteten af ​​brugen af ​​hudfibroblaster til diagnosticering af genetiske patologier hos WES- og WGS-negative patienter. Sidst men ikke mindst kan hudfibroblaster omprogrammeres til andre celletyper til mulige fremtidige analyser.

Dette projekt har til formål at identificere, gennem RNA-Seq-teknologi, de genetiske ændringer, der ligger til grund for udiagnosticerede sjældne sygdomme hos pædiatriske og voksne patienter med tidligt debut og med negativ WES.

Selvom NGS er afgørende for diagnosticering af genetiske sygdomme, varierer dens succesrater fra 30 % til 50 %. Fremkomsten af ​​RNA-Seq øgede chancen for at diagnosticere genetiske sygdomme fra 8% til 36%. Gennem dette projekt har vi til hensigt at anvende RNA-Seq-metoden, som en integration af WES-analysen, til diagnosticering af sjældne genetiske sygdomme:

• Mål 1: Opsætte og validere teknikker. Opsætning og validering af transkriptomanalyseprotokollen hos raske forsøgspersoner og hos patienter med kendte splejsningsændringer og/eller ændret RNA-ekspression.
• Mål 2: Diagnostisk fase. Undersøgelse af splejsningsændringer og RNA-niveauer i dyrkede fibroblaster opnået fra hudbiopsier af patienter med sjældne genetiske sygdomme og negativt exome.

Udforskende mål.

• Sammenlign RNA-ekspressionsprofilen opnået fra hudbiopsi-afledte fibroblaster med RNA-ekspressionsprofilen fra blod. De mest relevante resultater vil blive valideret i qRT-PCR.
• At analysere transkriptions- og proteinprofilens heterogenitet i hudafledte fibroblaster hos tilmeldte forsøgspersoner.

At udforske virkningerne af genetiske (fra WES) og transkriptionelle (fra RNA-seq) ændringer i deltagernes plasma og serum.

Sund kontrol. Fem raske forsøgspersoner vil blive rekrutteret fra personalet på Mario Negri Institute for Pharmacological Research. For at sikre beskyttelsen af ​​kategorien af ​​raske frivillige, er det forudset, at tilmeldingen overlades til sundhedspersonalet i Daccò Center, som via e-mail informerer alle ansatte på instituttet om muligheden for spontant at deltage i undersøgelsen . Ingen leder eller vejleder vil være involveret i rekrutteringen af ​​frivillige. Som en yderligere garanti for fortrolighed vil prøverne fra raske frivillige i forbindelse med undersøgelsen blive behandlet i kodet form. De kodede prøver vil blive brugt til at opsætte metoden til isolering og dyrkning af hudfibroblaster og RNA-Seq.

Valideringsgruppe. Til opsætning og validering af hudfibroblastisolering og RNA-Seq-proceduren vil ti voksne patienter med kendt diagnose og med ændringer i RNA-niveauer og/eller splejsning blive rekrutteret som positive kontroller.

Blandt disse vil patienter, der er ramt af atypisk hæmolytisk-uræmisk syndrom (aHUS), membranoproliferativ glomerulonefritis (MPGN), autosomal dominant polycystisk nyre (ADPKD) eller andre sjældne patologier, der tidligere er diagnosticeret på Daccò-centret, blive inkluderet, som har givet deres samtykke til indsamlingen og bevarelse (UNI EN ISO 9001 siden 2016; certificeringsnr. 6121) af prøverne i den certificerede biobank (Mario Negri Biologisk Ressourcecenter - Biobank for sjældne og nyresygdomme). Patienter, der opfylder de ovenfor beskrevne krav, vil blive kontaktet af lægerne på Daccò Centret for et interview, der forklarer projektet. De, der accepterer at deltage i undersøgelsen, vil blive bedt om at underskrive det informerede samtykke, før de fortsætter med den eksperimentelle del.

"Opdagelse/Udforskning" gruppe. Udforskningskohorten vil være sammensat af 30 symptomatiske udiagnosticerede patienter med mistanke om genetisk sygdom (børn og voksne med infantil debut), der tilhører det kliniske center for Mario Negri Institute for Pharmacological Research, og for hvem WES-undersøgelser ikke afslørede forårsagende genetiske ændringer. Til dette formål planlægger vi at rekruttere omkring 60 patienter, deres forældre og mere informative familiemedlemmer, hvis de er tilgængelige, som vil blive analyseret, hvis ikke tidligere, af WES. Baseret på litteraturen og vores erfaringer forventer vi, at WES-analyse vil være helbredende i 40-50% af tilfældene (Lunke et al., 2023). Derfor antager vi at identificere 30 patienter med negativ WES, og som derfor vil kunne komme ind i "Opdagelse/Udforskning" kohorten.

Efter at have underskrevet det informerede samtykke til indsamling og opbevaring af prøver (UNI EN ISO 9001 siden 2016; certificeringsnr. 6121) i den certificerede biobank (Mario Negri Biological Resources Center - Biobank for sjældne og nyresygdomme) og efter indsamling af klinisk information, patienter vil blive optaget i projektet.

Blod- og hudbiopsiprøver til DNA- og fibroblastisolering vil blive indsamlet som beskrevet nedenfor.

Til WES-analyserne tages 3 rør med 3 ml fuldblod i EDTA fra voksne og 2 rør med 3 ml fuldblod i EDTA fra børn og opbevares ved -20°C indtil brug. Blodindsamling vil blive foretaget på Mario Negri Institute-Daccò Center.

WES-analyserne vil blive udført på det kliniske forskningscenter for sjældne sygdomme "Aldo e Cele Daccò" eller i et specialiseret eksternt laboratorium, udvalgt under vores ansvar.

En yderligere 3 mL alikvot fuldblod vil blive trukket ind i TempusTM Blood RNA-rør til eksplorativ analyse.

En forskningsbiobank indeholdende biologisk materiale i form af blod, serum og plasma vil blive oprettet i "Mario Negri Biologiske Ressourcecenter - Sjældne Sygdomme og Nyresygdomme Biobank".

Ved det første besøg underskriver patienterne en undersøgelsesspecifik samtykkeerklæring, der indeholder specifikke oplysninger og valg vedrørende deltagelse i forskningsbiobanken, herunder muligheden for at bruge prøverne i fremtiden til yderligere forskningsundersøgelser.

Hvis forsøgspersoner giver deres samtykke, vil alikvoter af serum og plasma (1 x 2 ml plasma, 1 x 2 ml serum) blive opsamlet og opbevaret i kodet form i biobanken.