Desenvolvendo um pipeline para empregar RNA-Seq como uma ferramenta de diagnóstico complementar em doenças raras (ANTHEM)

As doenças genéticas raras são um grupo muito heterogêneo de doenças, muitas vezes não diagnosticadas, para as quais os pacientes recebem apenas tratamento sintomático. O desenvolvimento da tecnologia de sequenciação massiva de próxima geração (Next-Generation-Sequencing; NGS) permitiu identificar muitos dos genes responsáveis ​​por estas patologias, permitindo delinear os mecanismos patogénicos. Os métodos mais comumente usados, como sequenciamento de exoma (Whole-Exome Sequencing; WES) ou sequenciamento de genoma (Whole-Genome Sequencing; WGS), são baseados no sequenciamento de DNA e permitem identificar mutações patogênicas que causam perda de funcionalidade da proteína, como mutações stop, grandes inserções e deleções e a perda de sítios de splicing canônicos. Por outro lado, a atribuição de patogenicidade a uma variante de substituição de aminoácidos (missense) ou a uma variante sinônima é frequentemente questionável e, consequentemente, tais variantes são frequentemente categorizadas como Variantes de Significado Desconhecido (VUS). Além disso, o sequenciamento do exoma é incapaz de identificar possíveis variantes patogênicas localizadas em regiões não codificantes, como locais de splicing não canônicos ou variantes intrônicas profundas.

O sequenciamento WGS, embora permita a identificação de variantes presentes nas regiões não codificantes de um gene, é muito caro e produz uma enorme quantidade de dados com baixa informação patogênica. Algoritmos para analisar a possível patogenicidade de variantes intrônicas têm pouco poder preditivo e a patogenicidade das variantes identificadas deve ser validada por longas e complexas análises funcionais. Devido a essas limitações, aproximadamente 50% dos pacientes com doenças genéticas raras permanecem sem diagnóstico e não podem se beneficiar dos benefícios da medicina personalizada. O sequenciamento transcriptômico (RNA-Seq) permite determinar variações na sequência e níveis de RNA, fornecendo informações complementares àquelas obtidas com WES e WGS, melhorando assim a eficiência do diagnóstico genético. As alterações de splicing, que estão entre as principais causas de doenças genéticas e podem residir tanto em regiões intrônicas profundas quanto em regiões codificantes, podem ser identificadas por meio do sequenciamento de RNA. Variantes nas regiões regulatórias do gene, que são capazes de influenciar os níveis de expressão do RNA, também podem ser destacadas pelo RNA-Seq. Uma vez que a expressão do RNA, em termos de níveis e isoformas produzidas por splicing alternativo, é tecido-específico, o material biológico mais transcricionalmente informativo é certamente o tecido afetado. No entanto, isso nem sempre é fácil de conseguir e a coleta pode ser muito invasiva para o paciente. Nestes casos é possível recorrer ao uso de tecidos alternativos, como sangue total ou biópsias de pele, que apresentam baixa invasividade e amplo perfil de expressão de RNA. Fibroblastos obtidos de biópsias de pele, em particular, têm se mostrado a matriz alternativa mais confiável, homogênea e informativa para análise de RNA-Seq, em uma ampla gama de patologias. Yépez e colaboradores demonstraram que as informações obtidas do RNA-Seq dos fibroblastos da pele eram superiores às obtidas do sangue. Além disso, a análise do transcriptoma de fibroblastos da pele permitiu identificar níveis alterados de transcritos e anormalidades de splicing em doenças neuromusculares e do neurodesenvolvimento. Isso confirmou a eficácia do uso de fibroblastos da pele no diagnóstico de patologias genéticas em pacientes com WES e WGS negativos. Por último, mas não menos importante, os fibroblastos da pele podem ser reprogramados em outros tipos de células para possíveis análises futuras.

Este projeto visa identificar, através da tecnologia RNA-Seq, as alterações genéticas subjacentes a doenças raras não diagnosticadas em doentes pediátricos e adultos de início precoce e com WES negativo.

Embora a NGS seja essencial para o diagnóstico de doenças genéticas, suas taxas de sucesso variam de 30% a 50%. O advento do RNA-Seq aumentou a chance de diagnosticar doenças genéticas de 8% para 36%. Através deste projeto pretendemos aplicar o método RNA-Seq, como integração da análise WES, para o diagnóstico de doenças genéticas raras:

• Objetivo 1: Configurar e validar técnicas. Configuração e validação do protocolo de análise de transcriptoma em indivíduos saudáveis ​​e em pacientes com alterações de splicing conhecidas e/ou expressão de RNA alterada.
• Objetivo 2: Fase de diagnóstico. Estudo das alterações de splicing e níveis de RNA em cultura de fibroblastos obtidos de biópsias de pele de pacientes com doenças genéticas raras e exoma negativo.

Objetivos exploratórios.

• Compare o perfil de expressão de RNA obtido de fibroblastos derivados de biópsia de pele com o perfil de expressão de RNA de sangue. Os resultados mais relevantes serão validados em qRT-PCR.
• Analisar a heterogeneidade do perfil transcricional e proteico em fibroblastos derivados da pele em indivíduos inscritos.

Explorar os efeitos das alterações genéticas (de WES) e transcricionais (de RNA-seq) no plasma e no soro dos participantes.

Controles saudáveis. Cinco indivíduos saudáveis ​​serão recrutados da equipe do Instituto Mario Negri de Pesquisa Farmacológica. Para garantir a proteção da categoria de voluntários saudáveis, foi previsto que a inscrição seja confiada ao pessoal de saúde do Centro Daccò, que informará, via e-mail, todo o pessoal do Instituto sobre a possibilidade de ingressar espontaneamente no estudo . Nenhum gerente ou tutor estará envolvido no recrutamento de voluntários. Como garantia adicional de confidencialidade, para fins do estudo, as amostras de voluntários saudáveis ​​serão tratadas de forma codificada. As amostras codificadas serão utilizadas para a montagem do método de isolamento e cultura de fibroblastos de pele e RNA-Seq.

Grupo de validação. Para a configuração e validação do procedimento de isolamento de fibroblastos da pele e RNA-Seq, dez pacientes adultos com diagnóstico conhecido e com alterações nos níveis de RNA e/ou splicing serão recrutados como controles positivos.

Entre eles, serão incluídos os pacientes afetados pela Síndrome Hemolítico-Urêmica atípica (SHUa), Glomerulonefrite Membranoproliferativa (GNMP), Rim Policístico Autossômico Dominante (DRPAD) ou outras patologias raras previamente diagnosticadas no Centro Daccò, que tenham dado seu consentimento para a coleta e conservação (UNI EN ISO 9001 desde 2016; certificação n° 6121) das amostras no biobanco certificado (Centro de Recursos Biológicos Mario Negri - Biobanco de Doenças Raras e Renais). Os pacientes que reúnam os requisitos acima descritos serão contactados pelos médicos do Centro Daccò para uma entrevista explicativa do projeto. Aqueles que concordarem em participar do estudo serão solicitados a assinar o consentimento informado antes de prosseguir com a parte experimental.

Grupo "Descoberta/Exploração". A coorte de exploração será composta por 30 pacientes sintomáticos não diagnosticados com suspeita de doença genética (crianças e adultos com início infantil) pertencentes ao Centro Clínico do Instituto Mario Negri de Pesquisa Farmacológica e para os quais as investigações do WES não revelaram alterações genéticas causadoras. Para o efeito prevê-se o recrutamento de cerca de 60 doentes, seus pais e familiares mais informativos, se disponíveis, que serão analisados, caso não o tenham feito previamente, pelo WES. Com base na literatura e em nossa experiência, esperamos que a análise WES seja curativa em 40-50% dos casos (Lunke et al., 2023). Portanto, assumimos identificar 30 pacientes com WES negativo e que, portanto, poderão entrar na coorte "Descoberta/Exploração".

Após a assinatura do consentimento informado para a recolha e armazenamento de amostras (UNI EN ISO 9001 desde 2016; certificação n° 6121) no biobanco certificado (Centro de Recursos Biológicos Mario Negri - Biobanco de Doenças Raras e Renais) e após a recolha de informação clínica, pacientes serão inscritos no projeto.

Amostras de sangue e biópsia de pele para isolamento de DNA e fibroblastos serão coletadas conforme descrito abaixo.

Para as análises WES, serão retirados 3 tubos de 3 ml de sangue total em EDTA de adultos e 2 tubos de 3 ml de sangue total em EDTA de crianças e armazenados a -20°C até o uso. A coleta de sangue será feita no Instituto Mario Negri-Centro Daccò.

As análises WES serão realizadas no Centro de Pesquisa Clínica de Doenças Raras "Aldo e Cele Daccò" ou em laboratório externo especializado, selecionado sob nossa responsabilidade.

Uma alíquota adicional de 3 mL de sangue total será coletada em tubos TempusTM Blood RNA, para análise exploratória.

Um biobanco de pesquisa contendo material biológico na forma de sangue, soro e plasma será instalado no "Centro de Recursos Biológicos Mario Negri - Biobanco de Doenças Raras e Doenças Renais".

Na primeira visita, os pacientes assinarão um formulário de consentimento específico do estudo, contendo informações e escolhas específicas sobre a participação no biobanco de pesquisa, incluindo a possibilidade de usar as amostras no futuro para estudos de pesquisa adicionais.

Se os sujeitos derem seu consentimento, alíquotas de soro e plasma (1 x 2 ml de plasma, 1 x 2 ml de soro) serão coletadas e armazenadas de forma codificada no biobanco.