Sviluppo di una pipeline per impiegare RNA-Seq come strumento diagnostico complementare nelle malattie rare (ANTHEM)

Le malattie genetiche rare sono un gruppo molto eterogeneo di malattie, spesso non diagnosticate, per le quali i pazienti ricevono solo un trattamento sintomatico. Lo sviluppo della tecnologia di sequenziamento massivo di nuova generazione (Next-Generation-Sequencing; NGS) ha permesso di identificare molti dei geni responsabili di queste patologie, permettendo di delinearne i meccanismi patogenetici. Le metodiche più comunemente utilizzate, come il sequenziamento dell'esoma (Whole-Exome Sequencing; WES) o il sequenziamento del genoma (Whole-Genome Sequencing; WGS), si basano sul sequenziamento del DNA e consentono di identificare mutazioni patogene che causano la perdita di funzionalità proteica, come stop mutazioni, grandi inserzioni e delezioni e la perdita di siti di splicing canonici. Al contrario, l'attribuzione di patogenicità a una variante di sostituzione aminoacidica (missenso) oa una variante sinonimo è spesso discutibile e, di conseguenza, tali varianti sono spesso classificate come varianti di significato sconosciuto (VUS). Inoltre, il sequenziamento dell'esoma non è in grado di identificare possibili varianti patogene localizzate in regioni non codificanti, come siti di splicing non canonici o varianti introniche profonde.

Il sequenziamento WGS, pur consentendo l'identificazione delle varianti presenti nelle regioni non codificanti di un gene, è molto costoso e produce un'enorme quantità di dati con bassa informazione patogenetica. Gli algoritmi per analizzare la possibile patogenicità delle varianti introniche hanno scarso potere predittivo e la patogenicità delle varianti identificate deve essere convalidata da lunghe e complesse analisi funzionali. A causa di queste limitazioni, circa il 50% dei pazienti con malattie genetiche rare rimane non diagnosticato e non può beneficiare dei benefici della medicina personalizzata. Il sequenziamento del trascrittoma (RNA-Seq) consente di determinare variazioni nella sequenza e nei livelli di RNA, fornendo informazioni complementari a quelle ottenute con WES e WGS, migliorando così l'efficienza della diagnosi genetica. Le alterazioni di splicing, che sono tra le principali cause di malattie genetiche e possono risiedere sia in regioni introniche profonde che in regioni codificanti, possono essere identificate attraverso il sequenziamento dell'RNA. Varianti nelle regioni regolatorie del gene, che sono in grado di influenzare i livelli di espressione dell'RNA, possono anche essere evidenziate da RNA-Seq. Poiché l'espressione dell'RNA, in termini di livelli e isoforme prodotte dallo splicing alternativo, è tessuto-specifica, il materiale biologico più informativo trascrizionalmente è certamente il tessuto interessato. Tuttavia, questo non è sempre facile da ottenere e la raccolta può essere troppo invasiva per il paziente. In questi casi è possibile ricorrere all'utilizzo di tessuti alternativi, quali sangue intero o biopsie cutanee, che presentano una bassa invasività e un ampio profilo di espressione dell'RNA. I fibroblasti ottenuti da biopsie cutanee, in particolare, hanno dimostrato di essere la matrice alternativa più affidabile, omogenea e informativa per l'analisi RNA-Seq, in un'ampia gamma di patologie. Yépez e collaboratori hanno dimostrato che le informazioni ottenute dall'RNA-Seq dai fibroblasti cutanei erano superiori a quelle ottenute dal sangue. Inoltre, l'analisi del trascrittoma dei fibroblasti cutanei ha permesso di identificare livelli alterati di trascritti e anomalie di splicing nelle malattie neuromuscolari e del neurosviluppo. Ciò ha confermato l'efficacia dell'utilizzo dei fibroblasti cutanei nella diagnosi di patologie genetiche in pazienti WES e WGS negativi. Ultimo ma non meno importante, i fibroblasti cutanei possono essere riprogrammati in altri tipi di cellule per possibili analisi future.

Questo progetto mira a identificare, attraverso la tecnologia RNA-Seq, le alterazioni genetiche alla base di malattie rare non diagnosticate in pazienti pediatrici e adulti con esordio precoce e con WES negativo.

Sebbene NGS sia essenziale per la diagnosi delle malattie genetiche, le sue percentuali di successo vanno dal 30% al 50%. L'avvento dell'RNA-Seq ha aumentato la possibilità di diagnosticare malattie genetiche dall'8% al 36%. Attraverso questo progetto intendiamo applicare il metodo RNA-Seq, come integrazione dell'analisi WES, per la diagnosi di malattie genetiche rare:

• Obiettivo 1: impostare e convalidare le tecniche. Messa a punto e validazione del protocollo di analisi del trascrittoma in soggetti sani e in pazienti con note alterazioni di splicing e/o alterata espressione di RNA.
• Obiettivo 2: Fase diagnostica. Studio delle alterazioni di splicing e dei livelli di RNA in colture di fibroblasti ottenuti da biopsie cutanee di pazienti con malattie genetiche rare ed esoma negativo.

Obiettivi esplorativi.

• Confronta il profilo di espressione dell'RNA ottenuto dai fibroblasti derivati ​​dalla biopsia cutanea con il profilo di espressione dell'RNA dal sangue. I risultati più rilevanti saranno validati in qRT-PCR.
• Analizzare l'eterogeneità del profilo trascrizionale e proteico nei fibroblasti derivati ​​dalla pelle nei soggetti arruolati.

Esplorare gli effetti delle alterazioni genetiche (da WES) e trascrizionali (da RNA-seq) nel plasma e nel siero dei partecipanti.

Controlli sani. Cinque soggetti sani saranno reclutati dallo staff dell'Istituto per la Ricerca Farmacologica Mario Negri. Per garantire la tutela della categoria dei volontari sani, è stato previsto che l'arruolamento sia affidato al personale sanitario del Centro Daccò, il quale informerà, via mail, tutto il personale dell'Istituto della possibilità di aderire spontaneamente allo studio . Nessun dirigente o tutor sarà coinvolto nel reclutamento dei volontari. Ad ulteriore garanzia di riservatezza, ai fini dello studio, i campioni di volontari sani saranno trattati in forma codificata. I campioni codificati serviranno per impostare il metodo di isolamento e coltura di fibroblasti cutanei e RNA-Seq.

Gruppo di convalida. Per la messa a punto e la validazione dell'isolamento dei fibroblasti cutanei e della procedura RNA-Seq, dieci pazienti adulti con diagnosi nota e con alterazioni nei livelli di RNA e/o splicing saranno reclutati come controlli positivi.

Tra questi, saranno inclusi i pazienti affetti da Sindrome Emolitico-Uremica Atipica (SEUa), Glomerulonefrite Membranoproliferativa (MPGN), Rene Policistico Autosomico Dominante (ADPKD) o altre patologie rare precedentemente diagnosticate presso il Centro Daccò, che abbiano acconsentito alla raccolta e conservazione (UNI EN ISO 9001 dal 2016; certificazione n° 6121) dei campioni nella biobanca certificata (Centro Risorse Biologiche Mario Negri - Biobanca Malattie Rare e Renali). I pazienti in possesso dei requisiti sopra descritti verranno contattati dai medici del Centro Daccò per un colloquio illustrativo del progetto. A coloro che accettano di partecipare allo studio verrà chiesto di firmare il consenso informato prima di procedere con la parte sperimentale.

Gruppo "Scoperta/Esplorazione". La coorte esplorativa sarà composta da 30 pazienti sintomatici non diagnosticati con sospetta malattia genetica (bambini e adulti ad esordio infantile) appartenenti al Centro Clinico dell'Istituto per la Ricerca Farmacologica Mario Negri e per i quali le indagini WES non hanno evidenziato alterazioni genetiche causative. A tal fine prevediamo di reclutare circa 60 pazienti, i loro genitori e familiari più informati, se disponibili, che saranno analizzati, se non precedentemente, da WES. Sulla base della letteratura e della nostra esperienza, ci aspettiamo che l'analisi WES sia curativa nel 40-50% dei casi (Lunke et al., 2023). Ipotizziamo quindi di identificare 30 pazienti con WES negativo e che potranno quindi entrare nella coorte “Scoperta/Esplorazione”.

Dopo aver firmato il consenso informato alla raccolta e conservazione dei campioni (UNI EN ISO 9001 dal 2016; certificazione n° 6121) nella biobanca certificata (Centro Risorse Biologiche Mario Negri - Biobanca Malattie Rare e Renali) e dopo la raccolta delle informazioni cliniche, i pazienti saranno arruolati nel progetto.

I campioni di sangue e biopsia cutanea per l'isolamento del DNA e dei fibroblasti saranno raccolti come descritto di seguito.

Per le analisi WES, 3 provette da 3 ml di sangue intero in EDTA saranno prelevate da adulti e 2 provette da 3 ml di sangue intero in EDTA da bambini e conservate a -20°C fino al momento dell'uso. Il prelievo del sangue verrà effettuato presso l'Istituto Mario Negri-Centro Daccò.

Le analisi WES verranno eseguite presso il Centro di Ricerca Clinica per le Malattie Rare "Aldo e Cele Daccò" o in un laboratorio esterno specializzato, selezionato sotto la nostra responsabilità.

Un'ulteriore aliquota di 3 mL di sangue intero verrà aspirata nelle provette TempusTM Blood RNA, per l'analisi esplorativa.

Presso il "Centro risorse biologiche Mario Negri - Biobanca malattie rare e malattie renali" sarà allestita una biobanca di ricerca contenente materiale biologico sotto forma di sangue, siero e plasma.

Alla prima visita, i pazienti firmeranno un modulo di consenso specifico per lo studio, contenente informazioni e scelte specifiche relative alla partecipazione alla biobanca di ricerca, inclusa la possibilità di utilizzare i campioni in futuro per ulteriori studi di ricerca.

Se i soggetti danno il loro consenso, aliquote di siero e plasma (1 x 2 ml di plasma, 1 x 2 ml di siero) saranno raccolte e conservate in forma codificata nella biobanca.