Vývoj potrubí pro použití RNA-Seq jako doplňkového diagnostického nástroje u vzácných onemocnění (ANTHEM)

Vzácná genetická onemocnění jsou velmi heterogenní skupinou onemocnění, často nediagnostikovaných, u kterých pacienti dostávají pouze symptomatickou léčbu. Vývoj technologie masivního sekvenování nové generace (Next-Generation-Sequencing; NGS) umožnil identifikovat mnoho genů odpovědných za tyto patologie, což umožnilo nastínit patogenní mechanismy. Nejčastěji používané metody, jako je sekvenování exomu (Whole-Exome Sequencing; WES) nebo sekvenování genomu (Whole-Gome Sequencing; WGS), jsou založeny na sekvenování DNA a umožňují identifikovat patogenní mutace způsobující ztrátu funkčnosti proteinu, jako je např. zastavení mutací, velké inzerce a delece a ztráta kanonických míst sestřihu. Naopak přisouzení patogenity variantě aminokyselinové substituce (missense) nebo synonymní variantě je často sporné, a v důsledku toho jsou takové varianty často kategorizovány jako varianty neznámého významu (VUS). Kromě toho sekvenování exomů není schopno identifikovat možné patogenní varianty umístěné v nekódujících oblastech, jako jsou nekanonická místa sestřihu nebo hluboce intronové varianty.

WGS sekvenování, i když umožňuje identifikaci variant přítomných v nekódujících oblastech genu, je velmi nákladné a produkuje obrovské množství dat s nízkou patogenní informací. Algoritmy pro analýzu možné patogenity intronových variant mají malou prediktivní schopnost a patogenitu identifikovaných variant je nutné ověřit zdlouhavými a komplexními funkčními analýzami. Kvůli těmto omezením zůstává přibližně 50 % pacientů se vzácnými genetickými chorobami nediagnostikováno a nemohou využívat výhod personalizované medicíny. Sekvenování transkriptomu (RNA-Seq) umožňuje určit variace v sekvenci a hladinách RNA, poskytuje komplementární informace k informacím získaným pomocí WES a WGS, čímž se zlepšuje účinnost genetické diagnostiky. Sestřihové změny, které patří mezi hlavní příčiny genetických onemocnění a mohou se nacházet jak v hlubokých intronových oblastech, tak v kódujících oblastech, lze identifikovat pomocí sekvenování RNA. Varianty v regulačních oblastech genu, které jsou schopny ovlivnit hladiny exprese RNA, lze také zvýraznit pomocí RNA-Seq. Vzhledem k tomu, že exprese RNA, pokud jde o úrovně a izoformy produkované alternativním sestřihem, je tkáňově specifická, transkripčně nejinformativnějším biologickým materiálem je jistě postižená tkáň. Toho však není vždy snadné dosáhnout a odběr může být pro pacienta příliš invazivní. V těchto případech je možné uchýlit se k použití alternativních tkání, jako jsou biopsie plné krve nebo kůže, které mají nízkou invazivitu a široký profil exprese RNA. Zejména fibroblasty získané z kožních biopsií se ukázaly jako nejspolehlivější, homogenní a informativní alternativní matrice pro analýzu RNA-Seq v širokém spektru patologických stavů. Yépez a spolupracovníci prokázali, že informace získané z RNA-Seq z kožních fibroblastů byly lepší než informace získané z krve. Kromě toho analýza transkriptomu kožních fibroblastů umožnila identifikovat změněné hladiny transkriptů a sestřihové abnormality u neuromuskulárních a neurovývojových onemocnění. To potvrdilo účinnost použití kožních fibroblastů v diagnostice genetických patologií u WES a WGS negativních pacientů. V neposlední řadě lze kožní fibroblasty přeprogramovat na jiné typy buněk pro případné budoucí analýzy.

Tento projekt si klade za cíl identifikovat pomocí technologie RNA-Seq genetické změny, které jsou základem nediagnostikovaných vzácných onemocnění u dětských a dospělých pacientů s časným nástupem as negativním WES.

Ačkoli je NGS zásadní pro diagnostiku genetických onemocnění, její úspěšnost se pohybuje od 30 % do 50 %. Příchod RNA-Seq zvýšil šanci na diagnostiku genetických onemocnění z 8 % na 36 %. Prostřednictvím tohoto projektu hodláme použít metodu RNA-Seq jako integraci WES analýzy pro diagnostiku vzácných genetických onemocnění:

• Cíl 1: Nastavení a ověření technik. Nastavení a validace protokolu analýzy transkriptomu u zdravých subjektů a u pacientů se známými sestřihovými alteracemi a/nebo změněnou expresí RNA.
• Cíl 2: Diagnostická fáze. Studium sestřihových změn a hladin RNA v kultivovaných fibroblastech získaných z kožních biopsií pacientů se vzácnými genetickými chorobami a negativním exomem.

Průzkumné cíle.

• Porovnejte profil exprese RNA získaný z fibroblastů získaných z kožní biopsie s profilem exprese RNA z krve. Nejrelevantnější výsledky budou ověřeny pomocí qRT-PCR.
• Analyzovat heterogenitu transkripčního a proteinového profilu ve fibroblastech získaných z kůže u zařazených subjektů.

Prozkoumat účinky genetických (z WES) a transkripčních (z RNA-seq) změn v plazmě a séru účastníků.

Zdravé kontroly. Z pracovníků Institutu pro farmakologický výzkum Maria Negriho bude přijato pět zdravých subjektů. Pro zajištění ochrany kategorie zdravých dobrovolníků se předpokládá, že zařazením bude pověřen zdravotnický personál Centra Daccò, který bude e-mailem informovat všechny pracovníky ústavu o možnosti spontánního zapojení do studie. . Do náboru dobrovolníků se nebude zapojovat žádný manažer ani tutor. Jako další záruka důvěrnosti budou pro účely studie vzorky zdravých dobrovolníků zpracovány v kódované formě. Kódované vzorky budou použity k nastavení metody izolace a kultivace kožních fibroblastů a RNA-Seq.

Validační skupina. Pro nastavení a validaci izolace kožních fibroblastů a postupu RNA-Seq bude jako pozitivní kontrola vybráno deset dospělých pacientů se známou diagnózou a se změnami v hladinách RNA a/nebo sestřihu.

Mezi nimi budou zahrnuti pacienti postižení atypickým hemolyticko-uremickým syndromem (aHUS), membranoproliferativní glomerulonefritidou (MPGN), autosomálně dominantní polycystickou ledvinou (ADPKD) nebo jinými vzácnými patologiemi dříve diagnostikovanými v centru Daccò, kteří dali svůj souhlas s odběrem a konzervace (UNI EN ISO 9001 od roku 2016; certifikace č. 6121) vzorků v certifikované biobance (Mario Negri Biological Resources Center - Rare and Kidney Diseases Biobank). Pacienti, kteří splňují výše popsané požadavky, budou kontaktováni lékaři centra Daccò za účelem rozhovoru s vysvětlením projektu. Ti, kteří souhlasí s účastí ve studii, budou požádáni, aby podepsali informovaný souhlas před pokračováním v experimentální části.

Skupina "Objevování/Průzkum". Průzkumná kohorta bude složena z 30 symptomatických nediagnostikovaných pacientů s podezřením na genetické onemocnění (děti a dospělí s infantilním začátkem), kteří budou náležet do Klinického centra Institutu pro farmakologický výzkum Maria Negriho a u kterých vyšetřování WES neodhalila kauzální genetické změny. Za tímto účelem plánujeme přijmout asi 60 pacientů, jejich rodičů a více informativních rodinných příslušníků, pokud jsou k dispozici, kteří budou analyzováni, pokud tak neučiní dříve, WES. Na základě literatury a našich zkušeností očekáváme, že WES analýza bude kurativní ve 40–50 % případů (Lunke et al., 2023). Předpokládáme tedy, že identifikujeme 30 pacientů s negativním WES, kteří tedy budou moci vstoupit do kohorty „Discovery/Exploration“.

Po podepsání informovaného souhlasu s odběrem a uchováním vzorků (UNI EN ISO 9001 od roku 2016; certifikace č. 6121) v certifikované biobance (Mario Negri Biological Resources Center - Biobanka vzácných a ledvinových onemocnění) a po sběru klinických informací, do projektu budou zařazeni pacienti.

Vzorky krve a biopsie kůže pro izolaci DNA a fibroblastů budou odebrány, jak je popsáno níže.

Pro analýzy WES se odeberou 3 zkumavky po 3 ml plné krve v EDTA dospělým a 2 zkumavky po 3 ml plné krve v EDTA dětem a až do použití se skladují při -20 °C. Odběr krve bude probíhat v Mario Negri Institute-Daccò Center.

Analýzy WES budou prováděny v Centru klinického výzkumu vzácných onemocnění „Aldo e Cele Daccò“ nebo ve specializované externí laboratoři vybrané pod naší odpovědností.

Další 3 ml alikvot plné krve se odebere do zkumavek TempusTM Blood RNA pro průzkumnou analýzu.

Výzkumná biobanka obsahující biologický materiál ve formě krve, séra a plazmy bude zřízena v „Biobanka Mario Negri Biological Resource Center – Rare Diseases and Kidney Diseases Biobank“.

Při první návštěvě pacienti podepíší formulář souhlasu specifického pro studii, který obsahuje konkrétní informace a možnosti týkající se účasti ve výzkumné biobance, včetně možnosti použít vzorky v budoucnu pro další výzkumné studie.

Pokud subjekty dají souhlas, budou odebrány alikvoty séra a plazmy (1 x 2 ml plazmy, 1 x 2 ml séra) a uloženy v kódované formě v biobance.