Putkilinjan kehittäminen RNA-Seq:n käyttämiseksi täydentävänä diagnostisena työkaluna harvinaisissa sairauksissa (ANTHEM)

Harvinaiset geneettiset sairaudet ovat hyvin heterogeeninen, usein diagnosoimattomia sairauksia, joihin potilaat saavat vain oireenmukaista hoitoa. Seuraavan sukupolven massiivinen sekvensointiteknologian (Next-Generation-Sequencing; NGS) kehitys on mahdollistanut monien näistä patologioista vastuussa olevien geenien tunnistamisen, mikä mahdollistaa patogeenisten mekanismien hahmottamisen. Yleisimmin käytetyt menetelmät, kuten eksomisekvensointi (Whole-Exome Sequencing; WES) tai genomin sekvensointi (Whole-Genome Sequencing; WGS), perustuvat DNA-sekvensointiin ja mahdollistavat patogeenisten mutaatioiden tunnistamisen, jotka aiheuttavat proteiinin toiminnallisuuden menetystä, kuten esim. pysäyttää mutaatiot, suuret insertiot ja deleetiot sekä kanonisten silmukointikohtien katoamisen. Sitä vastoin patogeenisuuden antaminen aminohapposubstituutiovariantille (missense) tai synonyymivariantille on usein kyseenalaista, ja sen seurauksena tällaiset variantit luokitellaan usein Tuntemattoman merkityksen varianteiksi (VUS). Lisäksi eksomisekvensointi ei pysty tunnistamaan mahdollisia patogeenisiä variantteja, jotka sijaitsevat ei-koodaavilla alueilla, kuten ei-kanonisissa silmukointikohdissa tai syvissa intronisissa varianteissa.

WGS-sekvensointi mahdollistaa geenin ei-koodaavilla alueilla olevien varianttien tunnistamisen, mutta se on erittäin kallista ja tuottaa valtavan määrän dataa, jolla on alhainen patogeeninen informaatio. Algoritmeilla, joilla analysoidaan intronisten varianttien mahdollista patogeenisyyttä, on vähän ennustevoimaa, ja tunnistettujen varianttien patogeenisyys on validoitava pitkillä ja monimutkaisilla toiminnallisilla analyyseillä. Näiden rajoitusten vuoksi noin 50 % harvinaisista geneettisistä sairauksista kärsivistä potilaista jää diagnosoimatta eivätkä voi hyötyä henkilökohtaisen lääketieteen eduista. Transkriptoimisekvensointi (RNA-Seq) mahdollistaa RNA:n sekvenssin ja tasojen vaihtelujen määrittämisen, mikä täydentää WES:llä ja WGS:llä saatua tietoa, mikä parantaa geneettisen diagnoosin tehokkuutta. Silmukointimuutokset, jotka ovat geneettisten sairauksien tärkeimpiä syitä ja voivat sijaita sekä syvällä intronisilla alueilla että koodaavilla alueilla, voidaan tunnistaa RNA-sekvensoinnilla. Geenin säätelyalueiden muunnelmia, jotka pystyvät vaikuttamaan RNA:n ilmentymistasoihin, voidaan myös korostaa RNA-Seq:llä. Koska RNA:n ilmentyminen vaihtoehtoisen silmukoinnin tuottamien tasojen ja isoformien suhteen on kudosspesifistä, transkription kannalta informatiivisin biologinen materiaali on varmasti vahingoittunut kudos. Tämä ei kuitenkaan ole aina helppoa saavuttaa ja kokoelma voi olla liian invasiivinen potilaalle. Näissä tapauksissa on mahdollista turvautua vaihtoehtoisten kudosten, kuten kokoveri- tai ihobiopsioiden käyttöön, joilla on alhainen invasiivisuus ja laaja RNA-ekspressioprofiili. Etenkin ihobiopsioista saadut fibroblastit ovat osoittautuneet luotettavimmaksi, homogeenisimmaksi ja informatiivisimmaksi vaihtoehtoiseksi matriksiksi RNA-Seq-analyysissä useissa eri patologioissa. Yépez ja hänen yhteistyökumppaninsa osoittivat, että ihon fibroblasteista saadut RNA-Seq:stä saadut tiedot olivat parempia kuin verestä saadut tiedot. Lisäksi ihon fibroblastien transkription analyysi mahdollisti transkriptien muuttuneiden tasojen ja silmukointipoikkeavuuksien tunnistamisen hermo-lihas- ja hermoston kehityssairauksissa. Tämä vahvisti ihon fibroblastien käytön tehokkuuden geneettisten patologioiden diagnosoinnissa WES- ja WGS-negatiivisilla potilailla. Viimeisenä mutta ei vähäisimpänä, ihon fibroblastit voidaan ohjelmoida uudelleen muihin solutyyppeihin mahdollisia tulevia analyyseja varten.

Tämän hankkeen tavoitteena on tunnistaa RNA-Seq-teknologian avulla geneettiset muutokset, jotka ovat taustalla diagnosoimattomien harvinaisten sairauksien lapsi- ja aikuispotilailla, joilla on varhain alkava ja negatiivinen WES.

Vaikka NGS on välttämätön geneettisten sairauksien diagnosoinnissa, sen onnistumisaste vaihtelee 30–50 prosentin välillä. RNA-Seq:n tulo lisäsi mahdollisuutta diagnosoida geneettisiä sairauksia 8 prosentista 36 prosenttiin. Tämän projektin kautta aiomme soveltaa RNA-Seq-menetelmää WES-analyysin integrointina harvinaisten geneettisten sairauksien diagnosointiin:

• Tavoite 1: Määritä ja validoi tekniikat. Transkriptianalyysiprotokollan käyttöönotto ja validointi terveillä koehenkilöillä ja potilailla, joilla on tunnettuja silmukointimuutoksia ja/tai muuttunutta RNA-ekspressiota.
• Tavoite 2: Diagnostinen vaihe. Tutkimus silmukointimuutoksista ja RNA-tasoista viljellyissä fibroblasteissa, jotka on saatu harvinaisia ​​geneettisiä sairauksia ja negatiivista eksomia sairastavien potilaiden ihobiopsioista.

Tutkivia tavoitteita.

• Vertaa ihobiopsiaperäisistä fibroblasteista saatua RNA-ekspressioprofiilia verestä saatuun RNA-ilmentymisprofiiliin. Tärkeimmät tulokset validoidaan qRT-PCR:ssä.
• Analysoida transkription ja proteiiniprofiilin heterogeenisyyttä ihoperäisissä fibroblasteissa ilmoittautuneilla koehenkilöillä.

Tutkia geneettisten (WES:stä) ja transkription (RNA-seq:stä) muutosten vaikutuksia osallistujien plasmassa ja seerumissa.

Terveet kontrollit. Mario Negrin farmakologisen tutkimuslaitoksen henkilöstöstä rekrytoidaan viisi tervettä tutkittavaa. Terveiden vapaaehtoisten luokan suojelun varmistamiseksi on suunniteltu, että ilmoittautuminen on uskottu Daccò-keskuksen terveyshenkilöstölle, joka ilmoittaa sähköpostitse koko instituutin henkilökunnalle mahdollisuudesta spontaanisti liittyä tutkimukseen. . Mikään johtaja tai tutori ei osallistu vapaaehtoisten rekrytointiin. Luottamuksellisuuden lisätakuutena tutkimusta varten terveiden vapaaehtoisten näytteet käsitellään koodatussa muodossa. Koodattuja näytteitä käytetään ihon fibroblastien ja RNA-Seq:n eristys- ja viljelymenetelmän asettamiseen.

Validointiryhmä. Ihon fibroblastien eristämisen ja RNA-Seq-menettelyn määrittämistä ja validointia varten positiivisiksi kontrolleiksi otetaan kymmenen aikuista potilasta, joilla on tiedossa oleva diagnoosi ja joilla on muutoksia RNA-tasoissa ja/tai silmukoitumisessa.

Näihin otetaan mukaan potilaat, joilla on aiemmin Daccò-keskuksessa diagnosoitu epätyypillinen hemolyyttis-ureeminen oireyhtymä (aHUS), kalvoproliferatiivinen glomerulonefriitti (MPGN), autosomaalisesti dominoiva polykystinen munuainen (ADPKD) tai jokin muu harvinainen sairaus, jotka ovat antaneet suostumuksensa keräämiseen ja sertifioidun biopankin näytteiden säilyttäminen (UNI EN ISO 9001 vuodesta 2016; sertifiointi nro 6121) (Mario Negri Biological Resources Center - Rare and Kidney Diseases Biobank). Daccò-keskuksen lääkärit ottavat yhteyttä yllä kuvatut vaatimukset täyttäviin potilaisiin projektia selittävää haastattelua varten. Niitä, jotka suostuvat osallistumaan tutkimukseen, pyydetään allekirjoittamaan tietoinen suostumus ennen kokeellisen osan jatkamista.

"Discovery/Exploration" -ryhmä. Tutkimuskohortti koostuu 30 oireellisesta diagnosoimattomasta potilaasta, joilla on epäilty geneettistä sairautta (lapset ja aikuiset, joilla on infantiilisairaus), jotka kuuluvat Mario Negrin farmakologisen tutkimuslaitoksen kliiniseen keskukseen ja joille WES-tutkimukset eivät paljastaneet aiheuttavia geneettisiä muutoksia. Tätä tarkoitusta varten aiomme rekrytoida noin 60 potilasta, heidän vanhempansa ja mahdollisuuksien mukaan informatiivisempia perheenjäseniä, jotka WES analysoi, ellei sitä ole aiemmin tehnyt. Kirjallisuuden ja kokemuksemme perusteella odotamme, että WES-analyysi on parantava 40-50 %:ssa tapauksista (Lunke et al., 2023). Siksi oletamme tunnistavamme 30 potilasta, joilla on negatiivinen WES ja jotka pääsevät siksi "Discovery/Exploration" -kohorttiin.

Allekirjoitettuaan tietoisen suostumuksen näytteiden keräämiseen ja varastointiin (UNI EN ISO 9001 vuodesta 2016; sertifiointi nro 6121) sertifioidussa biopankissa (Mario Negri Biological Resources Center - Rare and Renal Diseases Biobank) ja kliinisen tiedon keruun jälkeen, potilaita otetaan mukaan hankkeeseen.

Veri- ja ihobiopsianäytteet DNA:n ja fibroblastien eristämistä varten kerätään alla kuvatulla tavalla.

WES-analyysejä varten otetaan aikuisilta 3 putkea 3 ml:n kokoverta EDTA:ssa ja 2 putkea 3 ml:n kokoverta EDTA:ssa lapsilta ja säilytetään -20 °C:ssa käyttöön asti. Verenotto tehdään Mario Negri Institute-Daccò -keskuksessa.

WES-analyysit tehdään harvinaisten sairauksien kliinisessä tutkimuskeskuksessa "Aldo e Cele Daccò" tai erikoistuneessa ulkoisessa laboratoriossa, joka on valittu vastuullamme.

Ylimääräinen 3 ml:n alikvootti kokoverta otetaan TempusTM Blood RNA -putkiin tutkivaa analyysiä varten.

Mario Negrin biologisten resurssien keskus - Harvinaisten sairauksien ja munuaistautien biopankkiin perustetaan tutkimusbiopankki, joka sisältää biologista materiaalia veren, seerumin ja plasman muodossa.

Ensimmäisellä käynnillä potilas allekirjoittaa tutkimuskohtaisen suostumuslomakkeen, jossa on tarkat tiedot ja valinnat osallistumisesta tutkimusbiopankkiin, mukaan lukien mahdollisuus käyttää näytteitä jatkossa lisätutkimuksiin.

Jos koehenkilöt antavat suostumuksensa, seerumin ja plasman alikvootit (1 x 2 ml plasmaa, 1 x 2 ml seerumia) kerätään ja säilytetään koodatussa muodossa biopankkiin.