Opracowanie rurociągu do zastosowania RNA-Seq jako uzupełniającego narzędzia diagnostycznego w rzadkich chorobach (ANTHEM)

Rzadkie choroby genetyczne to bardzo heterogenna grupa chorób, często niezdiagnozowanych, w przypadku których pacjenci otrzymują jedynie leczenie objawowe. Rozwój technologii masowego sekwencjonowania nowej generacji (Next-Generation-Sequencing; NGS) umożliwił identyfikację wielu genów odpowiedzialnych za te patologie, co pozwoliło na naszkicowanie mechanizmów patogenetycznych. Najczęściej stosowane metody, takie jak sekwencjonowanie egzomu (Whole-Exome Sequencing; WES) czy sekwencjonowanie genomu (Whole-Genome Sequencing; WGS), opierają się na sekwencjonowaniu DNA i pozwalają na identyfikację mutacji patogennych powodujących utratę funkcjonalności białek, takich jak: mutacje stop, duże insercje i delecje oraz utratę kanonicznych miejsc splicingu. I odwrotnie, przypisanie patogenności wariantowi podstawienia aminokwasu (zmiana sensu) lub wariantowi synonimicznemu jest często wątpliwe, w związku z czym takie warianty są często klasyfikowane jako warianty o nieznanym znaczeniu (VUS). Ponadto sekwencjonowanie egzomu nie jest w stanie zidentyfikować możliwych wariantów patogennych zlokalizowanych w regionach niekodujących, takich jak niekanoniczne miejsca składania lub głębokie warianty intronowe.

Sekwencjonowanie WGS, chociaż pozwala na identyfikację wariantów obecnych w niekodujących regionach genu, jest bardzo drogie i generuje ogromną ilość danych o niskiej patogenności. Algorytmy do analizy możliwej patogenności wariantów intronowych mają niewielką moc predykcyjną, a patogenność zidentyfikowanych wariantów musi zostać zweryfikowana przez długie i złożone analizy funkcjonalne. Ze względu na te ograniczenia około 50% pacjentów z rzadkimi chorobami genetycznymi pozostaje niezdiagnozowanych i nie może korzystać z dobrodziejstw medycyny spersonalizowanej. Sekwencjonowanie transkryptomu (RNA-Seq) pozwala określić zmiany w sekwencji i poziomie RNA, dostarczając informacji uzupełniających do tych uzyskanych za pomocą WES i WGS, poprawiając w ten sposób efektywność diagnostyki genetycznej. Zmiany splicingu, które są jedną z głównych przyczyn chorób genetycznych i mogą znajdować się zarówno w głębokich regionach intronowych, jak iw regionach kodujących, można zidentyfikować poprzez sekwencjonowanie RNA. Warianty w regionach regulatorowych genu, które są w stanie wpływać na poziomy ekspresji RNA, można również wyróżnić za pomocą RNA-Seq. Ponieważ ekspresja RNA, pod względem poziomów i izoform wytwarzanych przez alternatywny splicing, jest tkankowo specyficzna, materiałem biologicznym o największej transkrypcji jest z pewnością dotknięta tkanka. Jednak nie zawsze jest to łatwe do osiągnięcia, a pobieranie może być zbyt inwazyjne dla pacjenta. W takich przypadkach możliwe jest skorzystanie z alternatywnych tkanek, takich jak biopsje krwi pełnej lub skóry, które charakteryzują się niską inwazyjnością i szerokim profilem ekspresji RNA. W szczególności fibroblasty uzyskane z biopsji skóry okazały się najbardziej wiarygodną, ​​jednorodną i zawierającą wiele informacji alternatywną matrycą do analizy RNA-Seq w szerokim zakresie patologii. Yépez i współpracownicy wykazali, że informacje uzyskane z RNA-Seq z fibroblastów skóry były lepsze niż informacje uzyskane z krwi. Ponadto analiza transkryptomu fibroblastów skóry pozwoliła zidentyfikować zmienione poziomy transkryptów i nieprawidłowości splicingu w chorobach nerwowo-mięśniowych i neurorozwojowych. Potwierdziło to skuteczność wykorzystania fibroblastów skóry w diagnostyce patologii genetycznych u pacjentów z ujemnym wynikiem WES i WGS. Wreszcie, fibroblasty skóry można przeprogramować na inne typy komórek do ewentualnych przyszłych analiz.

Projekt ten ma na celu zidentyfikowanie, za pomocą technologii RNA-Seq, zmian genetycznych leżących u podstaw niezdiagnozowanych rzadkich chorób u dzieci i dorosłych pacjentów z wczesnym początkiem i ujemnym WES.

Chociaż NGS jest niezbędny do diagnozowania chorób genetycznych, jego skuteczność waha się od 30% do 50%. Pojawienie się RNA-Seq zwiększyło szansę na zdiagnozowanie chorób genetycznych z 8% do 36%. Poprzez ten projekt zamierzamy zastosować metodę RNA-Seq, jako integrację analizy WES, do diagnostyki rzadkich chorób genetycznych:

• Cel 1: Skonfiguruj i zweryfikuj techniki. Konfiguracja i walidacja protokołu analizy transkryptomu u osób zdrowych oraz u pacjentów ze znanymi zmianami splicingu i/lub zmienioną ekspresją RNA.
• Cel 2: Faza diagnostyczna. Badanie zmian splicingowych i poziomów RNA w hodowanych fibroblastach uzyskanych z biopsji skóry pacjentów z rzadkimi chorobami genetycznymi i ujemnym egzomem.

Cele eksploracyjne.

• Porównaj profil ekspresji RNA uzyskany z fibroblastów pochodzących z biopsji skóry z profilem ekspresji RNA z krwi. Najbardziej odpowiednie wyniki zostaną zweryfikowane w qRT-PCR.
• Aby przeanalizować heterogeniczność profilu transkrypcji i białka w fibroblastach pochodzących ze skóry u włączonych osób.

Zbadanie wpływu zmian genetycznych (z WES) i transkrypcyjnych (z RNA-seq) w osoczu i surowicy uczestników.

Zdrowe kontrole. Pięć zdrowych osób zostanie zrekrutowanych spośród personelu Instytutu Badań Farmakologicznych im. Mario Negriego. Aby zapewnić ochronę kategorii zdrowych ochotników, przewidziano powierzenie rekrutacji personelowi medycznemu Centrum Daccò, który drogą elektroniczną poinformuje cały personel Instytutu o możliwości dobrowolnego przyłączenia się do badania . Żaden menedżer ani tutor nie będzie zaangażowany w rekrutację wolontariuszy. Jako dodatkową gwarancję poufności, do celów badania próbki zdrowych ochotników będą traktowane w postaci zakodowanej. Zakodowane próbki zostaną wykorzystane do ustalenia metody izolacji i hodowli fibroblastów skóry i RNA-Seq.

Grupa walidacyjna. W celu przygotowania i walidacji izolacji fibroblastów skóry i procedury RNA-Seq, dziesięciu dorosłych pacjentów ze znaną diagnozą i zmianami w poziomie RNA i/lub splicingu zostanie zrekrutowanych jako kontrola pozytywna.

Wśród nich znajdą się pacjenci dotknięci atypowym zespołem hemolityczno-mocznicowym (aHUS), błoniastorozplemowym kłębuszkowym zapaleniem nerek (MPGN), autosomalnym dominującym zespołem policystycznych nerek (ADPKD) lub innymi rzadkimi patologiami zdiagnozowanymi wcześniej w Centrum Daccò, którzy wyrazili zgodę na pobranie i konserwacja (UNI EN ISO 9001 od 2016 r.; certyfikat nr 6121) próbek w certyfikowanym biobanku (Centrum Zasobów Biologicznych Mario Negri – Biobank chorób rzadkich i nerek). Z pacjentami spełniającymi powyższe wymagania skontaktują się lekarze Centrum Daccò w celu przeprowadzenia wywiadu wyjaśniającego projekt. Osoby, które wyrażą zgodę na udział w badaniu, zostaną poproszone o podpisanie świadomej zgody przed przystąpieniem do części eksperymentalnej.

Grupa „Odkrywanie/Eksploracja”. Kohorta eksploracyjna będzie się składać z 30 objawowych niezdiagnozowanych pacjentów z podejrzeniem choroby genetycznej (dzieci i dorośli z początkiem niemowlęcym) należących do Centrum Klinicznego Instytutu Badań Farmakologicznych Mario Negri i dla których badania WES nie ujawniły przyczynowych zmian genetycznych. W tym celu planujemy zrekrutować około 60 pacjentów, ich rodziców i bardziej poinformowanych członków rodziny, jeśli są dostępni, którzy zostaną przeanalizowani, jeśli nie zrobiono tego wcześniej, przez WES. Opierając się na literaturze i naszym doświadczeniu, spodziewamy się, że analiza WES przyniesie wyleczenie w 40-50% przypadków (Lunke i in., 2023). W związku z tym zakładamy zidentyfikowanie 30 pacjentów z ujemnym WES, którzy dzięki temu będą mogli wejść do kohorty „Discovery/Exploration”.

Po podpisaniu świadomej zgody na pobranie i przechowywanie próbek (UNI EN ISO 9001 od 2016; certyfikat nr 6121) w certyfikowanym biobanku (Centrum Zasobów Biologicznych Mario Negri – Biobank Rzadkich i Chorób Nerek) oraz po zebraniu informacji klinicznych, pacjentów zostanie włączonych do projektu.

Próbki krwi i biopsji skóry do izolacji DNA i fibroblastów zostaną zebrane w sposób opisany poniżej.

Do analizy WES pobiera się 3 probówki po 3 ml pełnej krwi w EDTA od dorosłych i 2 probówki po 3 ml pełnej krwi w EDTA od dzieci i przechowuje w temperaturze -20°C aż do użycia. Pobieranie krwi odbędzie się w Mario Negri Institute-Daccò Center.

Analizy WES będą wykonywane w Centrum Badań Klinicznych Chorób Rzadkich „Aldo e Cele Daccò” lub w specjalistycznym laboratorium zewnętrznym, wybranym na naszą odpowiedzialność.

Do probówek Tempus™ Blood RNA zostanie pobrana dodatkowa porcja 3 ml krwi pełnej w celu analizy eksploracyjnej.

W „Centrum Zasobów Biologicznych Mario Negri – Biobank Chorób Rzadkich i Chorób Nerek” powstanie biobank badawczy zawierający materiał biologiczny w postaci krwi, surowicy i osocza.

Podczas pierwszej wizyty pacjenci podpiszą formularz zgody na badanie, zawierający konkretne informacje i wybory dotyczące udziału w biobanku badawczym, w tym możliwość wykorzystania próbek w przyszłości do dodatkowych badań naukowych.

Jeśli badani wyrażą zgodę, zostaną pobrane porcje surowicy i osocza (1 x 2 ml osocza, 1 x 2 ml surowicy) i przechowywane w postaci zakodowanej w biobanku.