Csővezeték kifejlesztése az RNA-Seq-nek kiegészítő diagnosztikai eszközként történő alkalmazására ritka betegségek esetén (ANTHEM)

A ritka genetikai betegségek nagyon heterogén, gyakran nem diagnosztizált betegségek csoportját alkotják, amelyekre a betegek csak tüneti kezelésben részesülnek. A következő generációs masszív szekvenálási technológia (Next-Generation-Sequencing; NGS) kifejlesztése lehetővé tette számos e patológiáért felelős gén azonosítását, lehetővé téve a patogén mechanizmusok felvázolását. A leggyakrabban használt módszerek, mint például az exome szekvenálás (Whole-Exome Sequencing; WES) vagy a genom szekvenálás (Whole-Genome Sequencing; WGS), DNS szekvenáláson alapulnak, és lehetővé teszik a fehérje funkcionalitás elvesztését okozó patogén mutációk azonosítását, mint pl. megállítja a mutációkat, a nagy inszerciókat és deléciókat, valamint a kanonikus splicing helyek elvesztését. Ezzel szemben a patogenitásnak egy aminosav-szubsztitúciós variánshoz (missense) vagy egy szinonim variánshoz való hozzárendelése gyakran megkérdőjelezhető, következésképpen az ilyen változatokat gyakran az ismeretlen jelentőségű változatok (VUS) kategóriába sorolják. Ezenkívül az exome szekvenálás nem képes azonosítani a nem kódoló régiókban található lehetséges patogén variánsokat, például nem kanonikus illesztési helyeket vagy mély intron variánsokat.

A WGS szekvenálás, miközben lehetővé teszi a gén nem kódoló régióiban jelenlévő variánsok azonosítását, nagyon drága, és óriási mennyiségű, alacsony patogenitású információval rendelkező adatot termel. Az intronikus variánsok lehetséges patogenitását elemző algoritmusoknak csekély előrejelző erejük van, és az azonosított variánsok patogenitását hosszadalmas és összetett funkcionális elemzésekkel kell validálni. E korlátok miatt a ritka genetikai betegségben szenvedő betegek körülbelül 50%-a nem diagnosztizálódik, és nem részesülhet a személyre szabott orvoslás előnyeiből. A transzkriptom szekvenálás (RNA-Seq) lehetővé teszi az RNS szekvenciájának és szintjének variációinak meghatározását, kiegészítve a WES-sel és a WGS-sel nyert információkat, így javítva a genetikai diagnózis hatékonyságát. Az RNS szekvenálás segítségével azonosíthatók azok a splicing elváltozások, amelyek a genetikai betegségek fő okai közé tartoznak, és mind a mély intronikus régiókban, mind a kódoló régiókban találhatók. A gén szabályozó régióinak azon változatai, amelyek képesek befolyásolni az RNS expressziós szintet, szintén kiemelhetők az RNS-Seq segítségével. Mivel az RNS expressziója az alternatív splicing által előállított szintek és izoformák tekintetében szövetspecifikus, a transzkripciós szempontból leginkább informatív biológiai anyag minden bizonnyal az érintett szövet. Ezt azonban nem mindig könnyű elérni, és a gyűjtés túl invazív lehet a páciens számára. Ezekben az esetekben lehetőség van alternatív szövetek, például teljes vér vagy bőrbiopsziák alkalmazására, amelyek alacsony invazivitásúak és széles RNS-expressziós profillal rendelkeznek. Különösen a bőrbiopsziákból nyert fibroblasztok bizonyultak a legmegbízhatóbb, leghomogénebb és leginformatívabb alternatív mátrixnak az RNS-Seq analízishez a patológiák széles körében. Yépez és munkatársai bebizonyították, hogy a bőrfibroblasztokból származó RNS-Seq-ből nyert információ jobb, mint a vérből nyert információ. Ezenkívül a bőr fibroblasztjainak transzkriptumának elemzése lehetővé tette a transzkriptumok megváltozott szintjének és az illesztési rendellenességek azonosítását neuromuszkuláris és idegfejlődési betegségekben. Ez megerősítette a bőr fibroblasztok alkalmazásának hatékonyságát a genetikai patológiák diagnosztizálásában WES és WGS negatív betegeknél. Végül, de nem utolsósorban, a bőrfibroblasztok átprogramozhatók más sejttípusokba az esetleges jövőbeni elemzésekhez.

Ennek a projektnek az a célja, hogy az RNA-Seq technológián keresztül azonosítsa a nem diagnosztizált ritka betegségek hátterében álló genetikai elváltozásokat korai kezdetű és negatív WES-ben szenvedő gyermek- és felnőtt betegeknél.

Bár az NGS elengedhetetlen a genetikai betegségek diagnosztizálásához, sikerességi aránya 30% és 50% között mozog. Az RNA-Seq megjelenése 8%-ról 36%-ra növelte a genetikai betegségek diagnosztizálásának esélyét. A projekt keretében az RNA-Seq módszert, a WES analízis integrálásaként kívánjuk alkalmazni ritka genetikai betegségek diagnosztizálására:

• 1. cél: technikák felállítása és érvényesítése. A transzkriptomelemzési protokoll felállítása és validálása egészséges alanyokban és ismert splicing-elváltozásokkal és/vagy megváltozott RNS-expresszióval rendelkező betegeknél.
• 2. célkitűzés: Diagnosztikai szakasz. Ritka genetikai betegségben szenvedő és negatív exomában szenvedő betegek bőrbiopsziájából nyert tenyésztett fibroblasztok splicing-elváltozásainak és RNS-szintjének vizsgálata.

Feltáró célok.

• Hasonlítsa össze a bőrbiopsziából származó fibroblasztokból nyert RNS expressziós profilt a vérből származó RNS expressziós profillal. A legrelevánsabb eredményeket a qRT-PCR validálja.
• A transzkripciós és fehérjeprofil heterogenitásának elemzése bőreredetű fibroblasztokban bevont alanyokban.

A résztvevők plazmájában és szérumában bekövetkező genetikai (WES-ből) és transzkripciós (RNS-seq-ből) elváltozások hatásainak feltárása.

Egészséges ellenőrzések. A Mario Negri Farmakológiai Kutatóintézet munkatársai közül öt egészséges alanyt vesznek fel. Az egészséges önkéntesek kategóriájának védelme érdekében a beiratkozást a Daccò Központ egészségügyi személyzetére bízták, akik e-mailben tájékoztatják az Intézet minden munkatársát a vizsgálatba való spontán csatlakozás lehetőségéről. . Egyetlen menedzser vagy oktató sem vesz részt az önkéntesek toborzásában. A titoktartás további garanciájaként a vizsgálat céljaira az egészséges önkéntesek mintáit kódolt formában kezeljük. A kódolt mintákat a bőrfibroblasztok és az RNA-Seq izolálási és tenyésztési módszerének beállításához használjuk fel.

Érvényesítési csoport. A bőrfibroblaszt izolálás és az RNA-Seq eljárás felállításához és validálásához tíz olyan felnőtt beteget vesznek fel pozitív kontrollként, akiknek ismert a diagnózisa, és megváltoztak az RNS-szintek és/vagy splicing.

Ezek közé tartoznak az atípusos hemolitikus-urémiás szindrómában (aHUS), a membranoproliferatív glomerulonephritisben (MPGN), az autoszomális domináns policisztás vesében (ADPKD) vagy más, a Daccò Központban korábban diagnosztizált ritka patológiában szenvedő betegek, akik hozzájárultak a gyűjtéshez és a minősített biobankban (Mario Negri Biological Resources Center - Rare and Kidney Diseases Biobank) található minták konzerválása (UNI EN ISO 9001 2016 óta; 6121-es tanúsítvány). Azokkal a betegekkel, akik megfelelnek a fent leírt követelményeknek, a Daccò Központ orvosai felveszik a kapcsolatot, hogy interjút készítsenek a projektről. Azokat, akik beleegyeznek a vizsgálatba, alá kell írniuk a beleegyezésüket, mielőtt folytatnák a kísérleti részt.

„Felfedezés/Felfedezés” csoport. A feltáró csoport 30 tünetmentes, genetikai betegségre gyanús betegből áll (csecsemőkori kezdetű gyermekek és felnőttek), akik a Mario Negri Farmakológiai Kutatóintézet Klinikai Központjához tartoznak, és akiknél a WES-vizsgálatok nem tártak fel kiváltó genetikai elváltozást. Ennek érdekében mintegy 60 beteget, szüleiket és ha rendelkezésre állnak informatívabb családtagokat tervezünk toborozni, akiket, ha korábban nem, a WES elemezni fog. A szakirodalom és tapasztalataink alapján azt várjuk, hogy a WES elemzés az esetek 40-50%-ában gyógyító lesz (Lunke et al., 2023). Ezért feltételezzük, hogy azonosítunk 30 negatív WES-ben szenvedő beteget, akik így bekerülhetnek a „Felfedezés/Felfedezés” kohorszba.

A minősített biobankban (Mario Negri Biological Resources Center – Ritka és Vesebetegségek Biobankja) a minták gyűjtésére és tárolására vonatkozó tájékoztatáson alapuló beleegyezés (UNI EN ISO 9001 2016 óta; tanúsítás száma 6121), valamint a klinikai információk összegyűjtése után, betegeket vonnak be a projektbe.

A DNS és a fibroblaszt izolálásához vér- és bőrbiopsziás mintákat gyűjtenek az alábbiak szerint.

A WES-elemzésekhez 3 cső 3 ml-es EDTA-ban lévő teljes vért veszünk a felnőttektől, és 2 tubus 3 ml-es EDTA-s teljes vért gyermekektől, és felhasználásig -20 °C-on tároljuk. A vérvétel a Mario Negri Intézet-Daccò Központban történik.

A WES-elemzéseket az „Aldo e Cele Daccò” Ritka Betegségek Klinikai Kutatóközpontjában, vagy a mi felelősségünkre kiválasztott külső laboratóriumban végzik el.

A teljes vér további 3 ml-es aliquot részét TempusTM Blood RNS csövekbe vesznek feltáró elemzés céljából.

Vér, szérum és plazma formájában biológiai anyagot tartalmazó kutatási biobankot hoznak létre a „Mario Negri Biológiai Erőforrás Központ – Ritka Betegségek és Vesebetegségek Biobankjában”.

Az első látogatás alkalmával a betegek aláírnak egy tanulmányspecifikus beleegyezési űrlapot, amely konkrét információkat és választási lehetőségeket tartalmaz a kutatási biobankban való részvétellel kapcsolatban, beleértve a minták jövőbeni további kutatásokhoz való felhasználásának lehetőségét.

Ha az alanyok beleegyezésüket adják, a szérum és plazma alikvotjait (1 x 2 ml plazma, 1 x 2 ml szérum) összegyűjtjük és kódolt formában tároljuk a biobankban.