Разработка конвейера для использования RNA-Seq в качестве дополнительного диагностического инструмента при редких заболеваниях (ANTHEM)

Редкие генетические заболевания представляют собой очень разнородную группу заболеваний, часто недиагностированных, при которых больные получают только симптоматическое лечение. Развитие технологии массивного секвенирования следующего поколения (Next-Generation-Sequencing; NGS) позволило идентифицировать многие гены, ответственные за эти патологии, что позволило наметить патогенные механизмы. Наиболее часто используемые методы, такие как секвенирование экзома (Whole-Exome Sequencing; WES) или секвенирование генома (Whole-Genome Sequencing; WGS), основаны на секвенировании ДНК и позволяют выявлять патогенные мутации, вызывающие потерю функциональности белка, такие как остановить мутации, большие вставки и делеции и потерю канонических сайтов сплайсинга. И наоборот, приписывание патогенности варианту с аминокислотной заменой (миссенс) или синонимическому варианту часто вызывает сомнения, и, следовательно, такие варианты часто классифицируются как варианты неизвестного значения (VUS). Кроме того, секвенирование экзома не позволяет идентифицировать возможные патогенные варианты, расположенные в некодирующих областях, таких как неканонические сайты сплайсинга или варианты глубоких интронов.

Секвенирование WGS, хотя и позволяет идентифицировать варианты, присутствующие в некодирующих областях гена, очень дорого и дает огромное количество данных с низкой патогенной информацией. Алгоритмы для анализа возможной патогенности вариантов интронов имеют небольшую прогностическую силу, и патогенность идентифицированных вариантов должна быть подтверждена длительными и сложными функциональными анализами. Из-за этих ограничений примерно 50% пациентов с редкими генетическими заболеваниями остаются недиагностированными и не могут воспользоваться преимуществами персонализированной медицины. Секвенирование транскриптома (RNA-Seq) позволяет определять вариации в последовательности и уровнях РНК, предоставляя информацию, дополняющую информацию, полученную с помощью WES и WGS, что повышает эффективность генетической диагностики. Изменения сплайсинга, которые являются одной из основных причин генетических заболеваний и могут находиться как в глубоких интронных областях, так и в кодирующих областях, могут быть идентифицированы с помощью секвенирования РНК. Варианты в регуляторных областях гена, которые способны влиять на уровни экспрессии РНК, также могут быть выделены с помощью RNA-Seq. Поскольку экспрессия РНК, с точки зрения уровней и изоформ, продуцируемых альтернативным сплайсингом, является тканеспецифичной, наиболее транскрипционно информативным биологическим материалом, безусловно, является пораженная ткань. Однако этого не всегда легко добиться, и сбор может быть слишком инвазивным для пациента. В этих случаях можно прибегнуть к использованию альтернативных тканей, таких как биопсия цельной крови или кожи, которые обладают низкой инвазивностью и широким профилем экспрессии РНК. В частности, фибробласты, полученные из биопсии кожи, оказались наиболее надежной, гомогенной и информативной альтернативной матрицей для анализа РНК-Seq при широком спектре патологий. Йепез и его сотрудники продемонстрировали, что информация, полученная с помощью RNA-Seq из фибробластов кожи, превосходит информацию, полученную из крови. Кроме того, анализ транскриптома фибробластов кожи позволил выявить измененные уровни транскриптов и аномалии сплайсинга при нервно-мышечных заболеваниях и заболеваниях, связанных с развитием нервной системы. Это подтвердило эффективность использования фибробластов кожи в диагностике генетических патологий у WES- и WGS-отрицательных пациентов. И последнее, но не менее важное: фибробласты кожи могут быть перепрограммированы в другие типы клеток для возможных будущих анализов.

Этот проект направлен на выявление с помощью технологии RNA-Seq генетических изменений, лежащих в основе невыявленных редких заболеваний у детей и взрослых пациентов с ранним началом и с отрицательным WES.

Хотя NGS необходим для диагностики генетических заболеваний, его показатели успеха колеблются от 30% до 50%. Появление RNA-Seq увеличило вероятность диагностики генетических заболеваний с 8% до 36%. В рамках этого проекта мы намерены применить метод RNA-Seq как интеграцию анализа WES для диагностики редких генетических заболеваний:

• Задача 1: Настройка и проверка методов. Настройка и проверка протокола анализа транскриптома у здоровых субъектов и у пациентов с известными изменениями сплайсинга и/или измененной экспрессией РНК.
• Задача 2: Диагностический этап. Изучение изменений сплайсинга и уровней РНК в культивируемых фибробластах, полученных из биоптатов кожи пациентов с редкими генетическими заболеваниями и отрицательным экзомом.

Исследовательские цели.

• Сравните профиль экспрессии РНК, полученный из фибробластов, полученных из биопсии кожи, с профилем экспрессии РНК из крови. Наиболее релевантные результаты будут проверены в qRT-PCR.
• Проанализировать гетерогенность транскрипционного и белкового профиля в фибробластах кожи у включенных в исследование субъектов.

Изучить влияние генетических (от WES) и транскрипционных (от RNA-seq) изменений в плазме и сыворотке участников.

Здоровый контроль. Пять здоровых испытуемых будут набраны из числа сотрудников Института фармакологических исследований Марио Негри. Для обеспечения защиты категории здоровых добровольцев было предусмотрено, что регистрация возложена на медицинский персонал Центра Дакко, который будет информировать по электронной почте всех сотрудников Института о возможности спонтанного присоединения к исследованию. . Ни менеджер, ни наставник не будут участвовать в наборе волонтеров. В качестве дополнительной гарантии конфиденциальности в целях исследования образцы здоровых добровольцев будут обрабатываться в закодированной форме. Закодированные образцы будут использоваться для настройки метода выделения и культивирования фибробластов кожи и РНК-Seq.

Группа проверки. Для настройки и проверки выделения кожных фибробластов и процедуры RNA-Seq десять взрослых пациентов с известным диагнозом и изменениями уровней РНК и/или сплайсинга будут набраны в качестве положительных контролей.

Среди них будут включены пациенты с атипичным гемолитико-уремическим синдромом (аГУС), мембранопролиферативным гломерулонефритом (МПГН), аутосомно-доминантным поликистозом почек (АДПБП) или другими редкими патологиями, ранее диагностированными в центре Дакко, которые дали свое согласие на сбор и консервация (UNI EN ISO 9001 с 2016 г.; сертификат № 6121) образцов в сертифицированном биобанке (Центр биологических ресурсов Марио Негри – Биобанк редких и почечных заболеваний). Врачи центра Daccò свяжутся с пациентами, отвечающими описанным выше требованиям, для проведения собеседования с объяснением проекта. Тем, кто согласен участвовать в исследовании, будет предложено подписать информированное согласие, прежде чем приступить к экспериментальной части.

Группа «Открытие/Исследование». Исследовательская группа будет состоять из 30 недиагностированных пациентов с симптомами и подозрением на генетическое заболевание (детей и взрослых с инфантильным началом), принадлежащих Клиническому центру Института фармакологических исследований Марио Негри, у которых исследования WES не выявили причинных генетических изменений. С этой целью мы планируем набрать около 60 пациентов, их родителей и более информированных членов семьи, если таковые имеются, которые будут проанализированы, если это не было сделано ранее, с помощью WES. Основываясь на литературе и нашем опыте, мы ожидаем, что анализ WES будет излечивающим в 40-50% случаев (Lunke et al., 2023). Поэтому мы предполагаем выявить 30 пациентов с отрицательным WES, которые, следовательно, смогут войти в когорту «Открытие/исследование».

После подписания информированного согласия на сбор и хранение образцов (UNI EN ISO 9001 с 2016 г.; сертификат № 6121) в сертифицированном биобанке (Центр биологических ресурсов Марио Негри - Биобанк редких и почечных заболеваний) и после сбора клинической информации, пациенты будут включены в проект.

Образцы крови и биопсии кожи для выделения ДНК и фибробластов будут собираться, как описано ниже.

Для анализа WES берут 3 пробирки по 3 мл цельной крови с ЭДТА у взрослых и 2 пробирки по 3 мл цельной крови с ЭДТА у детей и хранят при температуре -20°C до использования. Сбор крови будет производиться в Центре Института Марио Негри-Дакко.

Анализы WES будут проводиться в Центре клинических исследований редких заболеваний «Aldo e Cele Daccò» или в специализированной внешней лаборатории, выбранной под нашу ответственность.

Дополнительные 3 мл аликвоты цельной крови будут взяты в пробирки TempusTM Blood RNA для исследовательского анализа.

Исследовательский биобанк, содержащий биологический материал в виде крови, сыворотки и плазмы, будет создан в «Центре биологических ресурсов Марио Негри - Биобанк редких заболеваний и заболеваний почек».

При первом посещении пациенты подписывают форму согласия на конкретное исследование, содержащую конкретную информацию и варианты участия в исследовательском биобанке, включая возможность использования образцов в будущем для дополнительных исследований.

Если субъекты дают свое согласие, аликвоты сыворотки и плазмы (1 х 2 мл плазмы, 1 х 2 мл сыворотки) будут собраны и сохранены в закодированной форме в биобанке.