Ontwikkeling van een pijplijn om RNA-Seq in te zetten als aanvullend diagnostisch hulpmiddel bij zeldzame ziekten (ANTHEM)

Zeldzame genetische ziekten zijn een zeer heterogene groep ziekten, vaak niet gediagnosticeerd, waarvoor patiënten alleen symptomatische behandeling krijgen. De ontwikkeling van massale sequencingtechnologie van de volgende generatie (Next-Generation-Sequencing; NGS) heeft het mogelijk gemaakt om veel van de genen te identificeren die verantwoordelijk zijn voor deze pathologieën, waardoor de pathogene mechanismen kunnen worden geschetst. De meest gebruikte methoden, zoals exome-sequencing (Whole-Exome Sequencing; WES) of genoomsequencing (Whole-Genome Sequencing; WGS), zijn gebaseerd op DNA-sequencing en maken het mogelijk om pathogene mutaties te identificeren die verlies van eiwitfunctionaliteit veroorzaken, zoals stop mutaties, grote inserties en deleties en het verlies van canonieke splitsingsplaatsen. Omgekeerd is de toekenning van pathogeniteit aan een aminozuursubstitutievariant (missense) of een synonieme variant vaak twijfelachtig en daarom worden dergelijke varianten vaak gecategoriseerd als Varianten van Onbekende Significantie (VUS). Bovendien kan exome-sequencing geen mogelijke pathogene varianten identificeren die zich in niet-coderende regio's bevinden, zoals niet-canonieke splitsingsplaatsen of diepe intronische varianten.

Hoewel WGS-sequencing de identificatie mogelijk maakt van varianten die aanwezig zijn in de niet-coderende regio's van een gen, is het erg duur en levert het een enorme hoeveelheid gegevens op met weinig pathogene informatie. Algoritmen om de mogelijke pathogeniteit van intronische varianten te analyseren hebben weinig voorspellende kracht en de pathogeniteit van de geïdentificeerde varianten moet worden gevalideerd door langdurige en complexe functionele analyses. Vanwege deze beperkingen blijft ongeveer 50% van de patiënten met zeldzame genetische ziekten niet gediagnosticeerd en kunnen ze niet profiteren van de voordelen van gepersonaliseerde geneeskunde. Transcriptome sequencing (RNA-Seq) maakt het mogelijk om variaties in de sequentie en niveaus van RNA te bepalen, waarbij informatie wordt verstrekt die complementair is aan die verkregen met WES en WGS, waardoor de efficiëntie van genetische diagnose wordt verbeterd. Splitsingsveranderingen, die tot de hoofdoorzaken van genetische ziekten behoren en zich zowel in diepe intronische regio's als in coderende regio's kunnen bevinden, kunnen worden geïdentificeerd door middel van RNA-sequencing. Varianten in de regulerende regio's van het gen, die RNA-expressieniveaus kunnen beïnvloeden, kunnen ook worden benadrukt door RNA-Seq. Aangezien RNA-expressie, in termen van niveaus en isovormen geproduceerd door alternatieve splicing, weefselspecifiek is, is het meest transcriptioneel informatieve biologische materiaal zeker het aangetaste weefsel. Dit is echter niet altijd gemakkelijk te realiseren en het verzamelen kan te ingrijpend zijn voor de patiënt. In deze gevallen is het mogelijk om gebruik te maken van alternatieve weefsels, zoals volbloed- of huidbiopten, die weinig invasief zijn en een breed RNA-expressieprofiel hebben. Met name fibroblasten verkregen uit huidbiopten hebben bewezen de meest betrouwbare, homogene en informatieve alternatieve matrix te zijn voor RNA-Seq-analyse, in een breed scala van pathologieën. Yépez en medewerkers toonden aan dat de informatie verkregen uit RNA-Seq van huidfibroblasten superieur was aan die verkregen uit bloed. Bovendien maakte de analyse van het transcriptoom van huidfibroblasten het mogelijk om veranderde niveaus van transcripten en splitsingsafwijkingen in neuromusculaire en neurologische ontwikkelingsziekten te identificeren. Dit bevestigde de werkzaamheid van het gebruik van huidfibroblasten bij de diagnose van genetische pathologieën bij WES- en WGS-negatieve patiënten. Last but not least kunnen huidfibroblasten worden geherprogrammeerd in andere celtypen voor mogelijke toekomstige analyses.

Dit project heeft tot doel om, door middel van RNA-Seq-technologie, de genetische veranderingen te identificeren die ten grondslag liggen aan niet-gediagnosticeerde zeldzame ziekten bij pediatrische en volwassen patiënten met vroege aanvang en met negatieve WES.

Hoewel NGS essentieel is voor de diagnose van genetische ziekten, variëren de slagingspercentages van 30% tot 50%. De komst van RNA-Seq verhoogde de kans op het diagnosticeren van genetische ziekten van 8% naar 36%. Via dit project willen we de RNA-Seq-methode toepassen, als een integratie van de WES-analyse, voor de diagnose van zeldzame genetische ziekten:

• Doel 1: Opzetten en valideren van technieken. Opzetten en valideren van het transcriptoomanalyseprotocol bij gezonde proefpersonen en bij patiënten met gekende splitsingsveranderingen en/of veranderde RNA-expressie.
• Doel 2: Diagnostische fase. Studie van splitsingsveranderingen en RNA-niveaus in gekweekte fibroblasten verkregen uit huidbiopten van patiënten met zeldzame genetische ziekten en negatief exoom.

Verkennende doelen.

• Vergelijk het RNA-expressieprofiel verkregen uit huidbiopsie-afgeleide fibroblasten met het RNA-expressieprofiel uit bloed. De meest relevante resultaten worden gevalideerd in qRT-PCR.
• Om de heterogeniteit van het transcriptie- en eiwitprofiel in van de huid afgeleide fibroblasten bij ingeschreven proefpersonen te analyseren.

Om de effecten van genetische (van WES) en transcriptionele (van RNA-seq) veranderingen in plasma en serum van deelnemers te onderzoeken.

Gezonde controles. Vijf gezonde proefpersonen zullen worden gerekruteerd uit het personeel van het Mario Negri Instituut voor Farmacologisch Onderzoek. Om de categorie gezonde vrijwilligers te beschermen, is overwogen dat de inschrijving wordt toevertrouwd aan het gezondheidspersoneel van het Daccò-centrum, dat via e-mail al het personeel van het Instituut zal informeren over de mogelijkheid om spontaan deel te nemen aan de studie . Bij de werving van vrijwilligers is geen manager of mentor betrokken. Als verdere garantie van vertrouwelijkheid zullen de monsters van gezonde vrijwilligers voor de doeleinden van het onderzoek in gecodeerde vorm worden behandeld. De gecodeerde monsters zullen worden gebruikt om de methode van isolatie en kweek van huidfibroblasten en RNA-Seq op te zetten.

Validatie groep. Voor het opzetten en valideren van de isolatie van huidfibroblasten en de RNA-Seq-procedure zullen tien volwassen patiënten met bekende diagnose en met veranderingen in RNA-niveaus en/of splicing worden aangeworven als positieve controles.

Hieronder vallen patiënten die lijden aan atypisch hemolytisch-uremisch syndroom (aHUS), membraanproliferatieve glomerulonefritis (MPGN), autosomaal dominante polycystische nier (ADPKD) of andere zeldzame pathologieën die eerder in het Daccò-centrum zijn gediagnosticeerd, die hun toestemming hebben gegeven voor het verzamelen en behoud (UNI EN ISO 9001 sinds 2016; certificering nr. 6121) van de monsters in de gecertificeerde biobank (Mario Negri Biological Resources Centre - Biobank voor zeldzame en nierziekten). Patiënten die aan de hierboven beschreven vereisten voldoen, zullen door de artsen van het Daccò-centrum worden gecontacteerd voor een interview waarin het project wordt uitgelegd. Degenen die ermee instemmen om aan het onderzoek deel te nemen, zullen worden gevraagd om de geïnformeerde toestemming te ondertekenen voordat ze verder gaan met het experimentele gedeelte.

Groep "Ontdekking/verkenning". Het verkenningscohort zal bestaan ​​uit 30 symptomatische niet-gediagnosticeerde patiënten met vermoedelijke genetische ziekte (kinderen en volwassenen met infantiel begin) behorend tot het Klinisch Centrum van het Mario Negri Instituut voor Farmacologisch Onderzoek en voor wie WES-onderzoeken geen oorzakelijke genetische veranderingen aan het licht brachten. Daartoe zijn we van plan om ongeveer 60 patiënten, hun ouders en meer informatieve familieleden, indien beschikbaar, te rekruteren die door WES zullen worden geanalyseerd, als dit niet eerder is gedaan. Op basis van de literatuur en onze ervaring verwachten we dat WES-analyse in 40-50% van de gevallen curatief zal zijn (Lunke et al., 2023). Daarom gaan we ervan uit 30 patiënten met negatieve WES te identificeren en die daarom in staat zullen zijn om deel te nemen aan het "Discovery/Exploration"-cohort.

Na ondertekening van de geïnformeerde toestemming voor het verzamelen en opslaan van monsters (UNI EN ISO 9001 sinds 2016; certificering nr. 6121) in de gecertificeerde biobank (Mario Negri Biological Resources Center - Rare and Renal Diseases Biobank) en na het verzamelen van klinische informatie, patiënten zullen worden ingeschreven in het project.

Bloed- en huidbiopsiemonsters voor DNA- en fibroblastisolatie zullen worden verzameld zoals hieronder beschreven.

Voor de WES-analyses worden bij volwassenen 3 buisjes van 3 ml volbloed in EDTA en bij kinderen 2 buisjes van 3 ml volbloed in EDTA afgenomen en tot gebruik bij -20°C bewaard. De bloedafname vindt plaats in het Mario Negri Institute-Daccò Center.

De WES-analyses zullen worden uitgevoerd in het Klinisch Onderzoekscentrum voor Zeldzame Ziekten "Aldo e Cele Daccò" of in een gespecialiseerd extern laboratorium, geselecteerd onder onze verantwoordelijkheid.

Er wordt een aanvullende aliquot van 3 ml volbloed in TempusTM Blood RNA-buisjes getrokken voor verkennende analyse.

In het "Mario Negri Biological Resource Center - Biobank Rare Diseases and Kidney Diseases" zal een onderzoeksbiobank worden opgezet met biologisch materiaal in de vorm van bloed, serum en plasma.

Bij het eerste bezoek ondertekenen patiënten een studiespecifiek toestemmingsformulier met specifieke informatie en keuzes met betrekking tot deelname aan de onderzoeksbiobank, inclusief de mogelijkheid om de monsters in de toekomst te gebruiken voor aanvullende onderzoeksstudies.

Als proefpersonen hun toestemming geven, worden aliquots van serum en plasma (1 x 2 ml plasma, 1 x 2 ml serum) verzameld en gecodeerd opgeslagen in de biobank.