Desarrollo de una tubería para emplear RNA-Seq como herramienta de diagnóstico complementaria en enfermedades raras (ANTHEM)

Las enfermedades genéticas raras son un grupo muy heterogéneo de enfermedades, a menudo no diagnosticadas, para las que los pacientes reciben únicamente tratamiento sintomático. El desarrollo de la tecnología de secuenciación masiva de última generación (Next-Generation-Sequencing; NGS) ha permitido identificar muchos de los genes responsables de estas patologías, permitiendo esbozar los mecanismos patogénicos. Los métodos más utilizados, como la secuenciación del exoma (Whole-Exome Sequencing; WES) o la secuenciación del genoma (Whole-Genome Sequencing; WGS), se basan en la secuenciación del ADN y permiten identificar mutaciones patogénicas que provocan la pérdida de funcionalidad de las proteínas, como detener mutaciones, inserciones y deleciones grandes y la pérdida de sitios de empalme canónicos. Por el contrario, la atribución de patogenicidad a una variante de sustitución de aminoácidos (missense) o una variante sinónima es a menudo cuestionable y, en consecuencia, dichas variantes a menudo se clasifican como variantes de significado desconocido (VUS). Además, la secuenciación del exoma no puede identificar posibles variantes patogénicas ubicadas en regiones no codificantes, como sitios de empalme no canónicos o variantes intrónicas profundas.

La secuenciación WGS, si bien permite la identificación de variantes presentes en las regiones no codificantes de un gen, es muy costosa y produce una enorme cantidad de datos con poca información patógena. Los algoritmos para analizar la posible patogenicidad de las variantes intrónicas tienen poco poder predictivo y la patogenicidad de las variantes identificadas debe validarse mediante análisis funcionales prolongados y complejos. Debido a estas limitaciones, aproximadamente el 50% de los pacientes con enfermedades genéticas raras quedan sin diagnosticar y no pueden beneficiarse de los beneficios de la medicina personalizada. La secuenciación del transcriptoma (RNA-Seq) permite determinar variaciones en la secuencia y niveles de RNA, proporcionando información complementaria a la obtenida con WES y WGS, mejorando así la eficiencia del diagnóstico genético. Las alteraciones de empalme, que se encuentran entre las principales causas de enfermedades genéticas y pueden residir tanto en regiones intrónicas profundas como en regiones codificantes, pueden identificarse mediante secuenciación de ARN. Las variantes en las regiones reguladoras del gen, que pueden influir en los niveles de expresión de ARN, también pueden resaltarse mediante RNA-Seq. Dado que la expresión de ARN, en términos de niveles e isoformas producidas por corte y empalme alternativo, es específica de tejido, el material biológico con mayor información transcripcional es sin duda el tejido afectado. Sin embargo, esto no siempre es fácil de lograr y la recolección puede ser demasiado invasiva para el paciente. En estos casos es posible recurrir al uso de tejidos alternativos, como sangre entera o biopsias de piel, que tienen baja invasividad y un amplio perfil de expresión de ARN. Los fibroblastos obtenidos de biopsias de piel, en particular, han demostrado ser la matriz alternativa más confiable, homogénea e informativa para el análisis de RNA-Seq, en una amplia gama de patologías. Yépez y colaboradores demostraron que la información obtenida de RNA-Seq de fibroblastos de piel era superior a la obtenida de sangre. Además, el análisis del transcriptoma de fibroblastos de piel permitió identificar niveles alterados de transcritos y anomalías de empalme en enfermedades neuromusculares y del neurodesarrollo. Esto confirmó la eficacia del uso de fibroblastos de piel en el diagnóstico de patologías genéticas en pacientes WES y WGS negativos. Por último, pero no menos importante, los fibroblastos de la piel se pueden reprogramar en otros tipos de células para posibles análisis futuros.

Este proyecto tiene como objetivo identificar, a través de la tecnología RNA-Seq, las alteraciones genéticas que subyacen a enfermedades raras no diagnosticadas en pacientes pediátricos y adultos de inicio temprano y con WES negativo.

Aunque la NGS es fundamental para el diagnóstico de enfermedades genéticas, sus tasas de éxito oscilan entre el 30 % y el 50 %. La llegada de RNA-Seq aumentó la posibilidad de diagnosticar enfermedades genéticas del 8 % al 36 %. A través de este proyecto pretendemos aplicar el método RNA-Seq, como integración del análisis WES, para el diagnóstico de enfermedades genéticas raras:

• Objetivo 1: Establecer y validar técnicas. Puesta a punto y validación del protocolo de análisis del transcriptoma en sujetos sanos y en pacientes con alteraciones conocidas de splicing y/o expresión de ARN alterada.
• Objetivo 2: Fase de diagnóstico. Estudio de alteraciones de splicing y niveles de ARN en fibroblastos cultivados obtenidos de biopsias de piel de pacientes con enfermedades genéticas raras y exoma negativo.

objetivos exploratorios.

• Compare el perfil de expresión de ARN obtenido de fibroblastos derivados de biopsia de piel con el perfil de expresión de ARN de la sangre. Los resultados más relevantes serán validados en qRT-PCR.
• Analizar la heterogeneidad del perfil transcripcional y proteico en fibroblastos derivados de la piel en sujetos inscritos.

Explorar los efectos de las alteraciones genéticas (de WES) y transcripcionales (de RNA-seq) en el plasma y el suero de los participantes.

Controles saludables. Cinco sujetos sanos serán reclutados del personal del Instituto Mario Negri de Investigaciones Farmacológicas. Para garantizar la protección de la categoría de voluntarios sanos, se ha previsto que la inscripción se encomiende al personal sanitario del Centro Daccò, que informará, por correo electrónico, a todo el personal del Instituto de la posibilidad de incorporarse espontáneamente al estudio. . Ningún responsable o tutor participará en la captación de voluntarios. Como garantía adicional de confidencialidad, a efectos del estudio, las muestras de voluntarios sanos se tratarán de forma codificada. Las muestras codificadas se utilizarán para establecer el método de aislamiento y cultivo de fibroblastos de piel y RNA-Seq.

Grupo de validación. Para la puesta a punto y validación del procedimiento de aislamiento de fibroblastos de piel y RNA-Seq, se reclutarán como controles positivos diez pacientes adultos con diagnóstico conocido y con alteraciones en los niveles de RNA y/o splicing.

Entre estos, se incluirán pacientes afectados de Síndrome Hemolítico-Urémico atípico (SHUa), Glomerulonefritis Membranoproliferativa (GNMP), Riñón Poliquístico Autosómico Dominante (PQRAD) u otras patologías raras previamente diagnosticadas en el Centro Daccò, que hayan dado su consentimiento para la recogida y conservación (UNI EN ISO 9001 desde 2016; certificación n° 6121) de las muestras en el biobanco certificado (Centro de Recursos Biológicos Mario Negri - Biobanco de Enfermedades Raras y Renales). Los pacientes que cumplan con los requisitos descritos anteriormente serán contactados por los médicos del Centro Daccò para una entrevista explicando el proyecto. A quienes acepten participar en el estudio se les pedirá que firmen el consentimiento informado antes de proceder con la parte experimental.

Grupo "Descubrimiento/Exploración". La cohorte de exploración estará compuesta por 30 pacientes sintomáticos no diagnosticados con sospecha de enfermedad genética (niños y adultos con inicio infantil) pertenecientes al Centro Clínico del Instituto Mario Negri de Investigaciones Farmacológicas y en quienes las investigaciones WES no revelaron alteraciones genéticas causales. Con este fin, planeamos reclutar alrededor de 60 pacientes, sus padres y más familiares informativos, si están disponibles, quienes serán analizados, si no lo han hecho previamente, por WES. Según la literatura y nuestra experiencia, esperamos que el análisis WES sea curativo en el 40-50% de los casos (Lunke et al., 2023). Por lo tanto, suponemos identificar 30 pacientes con WES negativo y que, por lo tanto, podrán ingresar a la cohorte "Descubrimiento/Exploración".

Después de firmar el consentimiento informado para la recolección y almacenamiento de muestras (UNI EN ISO 9001 desde 2016; certificación n° 6121) en el biobanco certificado (Centro de Recursos Biológicos Mario Negri - Biobanco de Enfermedades Raras y Renales) y después de la recolección de información clínica, los pacientes serán inscritos en el proyecto.

Las muestras de biopsia de sangre y piel para el aislamiento de ADN y fibroblastos se recolectarán como se describe a continuación.

Para los análisis WES se tomarán 3 tubos de 3 ml de sangre total en EDTA de adultos y 2 tubos de 3 ml de sangre total en EDTA de niños y se almacenarán a -20°C hasta su uso. La extracción de sangre se realizará en el Instituto Mario Negri-Centro Daccò.

Los análisis WES se realizarán en el Centro de Investigación Clínica de Enfermedades Raras "Aldo e Cele Daccò" o en un laboratorio externo especializado, seleccionado bajo nuestra responsabilidad.

Se extraerá una alícuota adicional de 3 ml de sangre completa en tubos TempusTM Blood RNA para un análisis exploratorio.

En el "Centro de Recursos Biológicos Mario Negri - Biobanco de Enfermedades Raras y Enfermedades Renales" se instalará un biobanco de investigación con material biológico en forma de sangre, suero y plasma.

En la primera visita, los pacientes firmarán un formulario de consentimiento específico del estudio, que contiene información y opciones específicas con respecto a la participación en el biobanco de investigación, incluida la posibilidad de usar las muestras en el futuro para estudios de investigación adicionales.

Si los sujetos dan su consentimiento, se recogerán alícuotas de suero y plasma (1 x 2 ml de plasma, 1 x 2 ml de suero) y se almacenarán de forma codificada en el biobanco.