Développer un pipeline pour utiliser RNA-Seq comme outil de diagnostic complémentaire dans les maladies rares (ANTHEM)

Les maladies génétiques rares sont un groupe très hétérogène de maladies, souvent non diagnostiquées, pour lesquelles les patients ne reçoivent qu'un traitement symptomatique. Le développement de la technologie de séquençage massif de nouvelle génération (Next-Generation-Sequencing ; NGS) a permis d'identifier de nombreux gènes responsables de ces pathologies, permettant d'en préciser les mécanismes pathogènes. Les méthodes les plus couramment utilisées, telles que le séquençage de l'exome (Whole-Exome Sequencing ; WES) ou le séquençage du génome (Whole-Genome Sequencing ; WGS), sont basées sur le séquençage de l'ADN et permettent d'identifier les mutations pathogènes qui entraînent une perte de fonctionnalité des protéines, telles que stopper les mutations, les grandes insertions et délétions et la perte des sites d'épissage canoniques. À l'inverse, l'attribution de la pathogénicité à un variant de substitution d'acides aminés (faux sens) ou à un variant synonyme est souvent discutable et, par conséquent, ces variants sont souvent classés dans la catégorie des variants de signification inconnue (VUS). De plus, le séquençage de l'exome est incapable d'identifier d'éventuelles variantes pathogènes situées dans des régions non codantes, telles que des sites d'épissage non canoniques ou des variantes introniques profondes.

Le séquençage WGS, tout en permettant l'identification de variants présents dans les régions non codantes d'un gène, est très coûteux et produit une énorme quantité de données avec peu d'informations pathogènes. Les algorithmes d'analyse de la pathogénicité éventuelle des variants introniques ont peu de pouvoir prédictif et la pathogénicité des variants identifiés doit être validée par des analyses fonctionnelles longues et complexes. En raison de ces limitations, environ 50 % des patients atteints de maladies génétiques rares ne sont pas diagnostiqués et ne peuvent bénéficier des avantages de la médecine personnalisée. Le séquençage du transcriptome (RNA-Seq) permet de déterminer les variations de la séquence et des niveaux d'ARN, fournissant des informations complémentaires à celles obtenues avec WES et WGS, améliorant ainsi l'efficacité du diagnostic génétique. Les altérations d'épissage, qui sont parmi les principales causes de maladies génétiques et peuvent résider à la fois dans les régions introniques profondes et dans les régions codantes, peuvent être identifiées par séquençage de l'ARN. Des variants dans les régions régulatrices du gène, capables d'influencer les niveaux d'expression de l'ARN, peuvent également être mis en évidence par RNA-Seq. Étant donné que l'expression de l'ARN, en termes de niveaux et d'isoformes produits par l'épissage alternatif, est spécifique au tissu, le matériel biologique le plus informatif sur la transcription est certainement le tissu affecté. Cependant, cela n'est pas toujours facile à réaliser et le prélèvement peut être trop invasif pour le patient. Dans ces cas, il est possible de recourir à l'utilisation de tissus alternatifs, tels que le sang total ou les biopsies cutanées, qui ont un faible pouvoir invasif et un large profil d'expression d'ARN. Les fibroblastes obtenus à partir de biopsies cutanées, en particulier, se sont révélés être la matrice alternative la plus fiable, homogène et informative pour l'analyse RNA-Seq, dans un large éventail de pathologies. Yépez et ses collaborateurs ont démontré que les informations obtenues à partir de l'ARN-Seq des fibroblastes cutanés étaient supérieures à celles obtenues à partir du sang. De plus, l'analyse du transcriptome des fibroblastes cutanés a permis d'identifier des niveaux altérés de transcrits et des anomalies d'épissage dans les maladies neuromusculaires et neurodéveloppementales. Ceci a confirmé l'efficacité de l'utilisation des fibroblastes cutanés dans le diagnostic des pathologies génétiques chez les patients WES et WGS négatifs. Enfin, les fibroblastes cutanés peuvent être reprogrammés dans d'autres types de cellules pour d'éventuelles analyses futures.

Ce projet vise à identifier, grâce à la technologie RNA-Seq, les altérations génétiques sous-jacentes aux maladies rares non diagnostiquées chez les patients pédiatriques et adultes présentant un début précoce et un WES négatif.

Bien que le NGS soit essentiel pour le diagnostic des maladies génétiques, ses taux de réussite varient de 30 % à 50 %. L'avènement du RNA-Seq a augmenté les chances de diagnostiquer des maladies génétiques de 8% à 36%. A travers ce projet, nous avons l'intention d'appliquer la méthode RNA-Seq, en tant qu'intégration de l'analyse WES, pour le diagnostic de maladies génétiques rares :

• Objectif 1 : Mettre en place et valider des techniques. Mise en place et validation du protocole d'analyse du transcriptome chez des sujets sains et chez des patients présentant des altérations d'épissage connues et/ou une expression altérée de l'ARN.
• Objectif 2 : Phase de diagnostic. Étude des altérations d'épissage et des niveaux d'ARN dans des fibroblastes en culture obtenus à partir de biopsies cutanées de patients atteints de maladies génétiques rares et d'exome négatif.

Objectifs exploratoires.

• Comparez le profil d'expression d'ARN obtenu à partir de fibroblastes dérivés de la biopsie cutanée avec le profil d'expression d'ARN du sang. Les résultats les plus pertinents seront validés en qRT-PCR.
• Analyser l'hétérogénéité du profil transcriptionnel et protéique dans les fibroblastes dérivés de la peau chez les sujets inscrits.

Explorer les effets des altérations génétiques (de WES) et transcriptionnelles (de RNA-seq) dans le plasma et le sérum des participants.

Contrôles sains. Cinq sujets sains seront recrutés parmi le personnel de l'Institut Mario Negri de recherche pharmacologique. Pour assurer la protection de la catégorie des volontaires sains, il a été prévu que l'inscription soit confiée au personnel de santé du Centre Daccò, qui informera, par e-mail, tout le personnel de l'Institut de la possibilité de rejoindre spontanément l'étude . Aucun responsable ou tuteur ne sera impliqué dans le recrutement des bénévoles. Comme garantie supplémentaire de confidentialité, pour les besoins de l'étude, les échantillons de volontaires sains seront traités sous forme codée. Les échantillons codés seront utilisés pour mettre en place la méthode d'isolement et de culture des fibroblastes cutanés et RNA-Seq.

Groupe de validation. Pour la mise en place et la validation de la procédure d'isolement des fibroblastes cutanés et d'ARN-Seq, dix patients adultes avec un diagnostic connu et présentant des altérations des niveaux d'ARN et/ou d'épissage seront recrutés comme témoins positifs.

Parmi ceux-ci, seront inclus les patients atteints de syndrome hémolytique et urémique atypique (SHUa), de glomérulonéphrite membranoproliférative (MPGN), de rein polykystique autosomique dominant (ADPKD) ou d'autres pathologies rares précédemment diagnostiquées au Centre Daccò, qui ont donné leur consentement à la collecte et conservation (UNI EN ISO 9001 depuis 2016 ; certification n° 6121) des échantillons dans la biobanque certifiée (Centre de Ressources Biologiques Mario Negri - Biobanque Maladies Rares et Rénales). Les patients qui remplissent les conditions décrites ci-dessus seront contactés par les médecins du Centre Daccò pour un entretien expliquant le projet. Ceux qui acceptent de participer à l'étude seront invités à signer le consentement éclairé avant de procéder à la partie expérimentale.

Groupe "Découverte/Exploration". La cohorte d'exploration sera composée de 30 patients symptomatiques non diagnostiqués avec suspicion de maladie génétique (enfants et adultes à début infantile) appartenant au Centre clinique de l'Institut Mario Negri de recherche pharmacologique et pour lesquels les investigations du WES n'ont pas révélé d'altérations génétiques causales. À cette fin, nous prévoyons de recruter environ 60 patients, leurs parents et des membres de la famille plus informatifs, si disponibles, qui seront analysés, si ce n'est fait auparavant, par WES. Sur la base de la littérature et de notre expérience, nous prévoyons que l'analyse WES sera curative dans 40 à 50 % des cas (Lunke et al., 2023). Nous supposons donc identifier 30 patients avec un WES négatif et qui pourront donc entrer dans la cohorte "Découverte/Exploration".

Après signature du consentement éclairé à la collecte et au stockage des échantillons (UNI EN ISO 9001 depuis 2016 ; certification n° 6121) dans la biobanque certifiée (Centre de Ressources Biologiques Mario Negri - Biobanque des Maladies Rares et Rénales) et après la collecte des informations cliniques, les patients seront inscrits au projet.

Des échantillons de sang et de biopsie cutanée pour l'isolement de l'ADN et des fibroblastes seront prélevés comme décrit ci-dessous.

Pour les analyses WES, 3 tubes de 3 ml de sang total sur EDTA seront prélevés chez l'adulte et 2 tubes de 3 ml de sang total sur EDTA chez l'enfant et conservés à -20°C jusqu'à utilisation. La collecte de sang se fera à l'Institut Mario Negri-Centre Daccò.

Les analyses WES seront effectuées au Centre de Recherche Clinique sur les Maladies Rares "Aldo e Cele Daccò" ou dans un laboratoire externe spécialisé, sélectionné sous notre responsabilité.

Une aliquote supplémentaire de 3 ml de sang total sera prélevée dans des tubes TempusTM Blood RNA, pour une analyse exploratoire.

Une biobanque de recherche contenant du matériel biologique sous forme de sang, de sérum et de plasma sera mise en place au "Mario Negri Biological Resource Center - Rare Diseases and Kidney Diseases Biobank".

Lors de la première visite, les patients signeront un formulaire de consentement spécifique à l'étude, contenant des informations spécifiques et des choix concernant la participation à la biobanque de recherche, y compris la possibilité d'utiliser les échantillons à l'avenir pour des études de recherche supplémentaires.

Si les sujets donnent leur consentement, des aliquotes de sérum et de plasma (1 x 2 ml de plasma, 1 x 2 ml de sérum) seront prélevés et conservés sous forme codée dans la biobanque.