Effektene av kronisk trening på UCP1-genet i humant hvitt fettvev

Etterforskerne innhentet tre (baseline, post-trening, post-de-trening) subkutane fettbiopsier fra 32 friske menn som gjennomførte tre forskjellige åtte ukers treningsprogrammer [aerobic (9 deltakere), motstand (8 deltakere), kombinert (aerobic+resistens) , 8 deltakere)] og en ikke-treningsgruppe (7 deltakere), etterfulgt av en åtte ukers avtreningsperiode. Treningsintensiteten ble satt til 65 % av maksimalt oksygenforbruk (VO2peak) og 1 repetisjon maksimalt (1RM) gjennom treningsperioden, mens innholdet i treningsprogrammene basert på en tidligere studie som undersøkte PGC1a-genet, som antas å øke UCP1 i humant hvitt fettvev (WAT). Trening utført i tre lokale treningssentre i Trikala, Thessaly, Hellas, hver for hver treningsgruppe for å unngå krysskontaminering mellom deltakerne, mens treningsveilederne ble blindet for målet med studien. Målinger for antropometri, kroppssammensetning, hvileenergiforbruk (REE) og subkutan fettbiopsi ble oppnådd ved baseline, post-trening (uke 8) og etter avtrening (uke 16), mens diettdata ble samlet inn tilfeldig for to ukedager og en helgedag ved baseline, 8. og 16. uke. VO2peak og 1RM ble målt ved baseline, 4. (for å justere den nødvendige treningsintensiteten til 65%), 8. og 16. uke.

Antropometri Deltakerne besøkte laboratoriet mellom kl. 07.00 og 09.00 og følgende antropometriske mål deltok: Høyde ble målt ved hjelp av en Seca (Hamburg, Tyskland) enhet og vekt ved hjelp av en skala (KERN & Sohn GmbH, versjon 5.3, Tyskland ) mens midje-til-hofte-forholdet ble målt ved hjelp av et målebånd og blodtrykk ved hjelp av en akustisk metode ved bruk av et aneroid-sfygmomanometer. Prosent kroppsfett og fettfri masse ble målt via bioelektrisk impedans ved bruk av en kroppssammensetningsmonitor (Fresenius Medical Care AG & Co. KGaA D-61346 Bad Hamburg, Tyskland).

Fettbiopsier Alle biopsier ble utført av en erfaren kirurg etter en tidligere metodikk via en ikke-diatermimetode. Deltakerne gjennomgikk en subkutan fettbiopsi etter minst åtte timers faste, og de ble bedt om å avstå fra trening, alkohol og passiv røyking i 72 timer før biopsiprosedyren for å minimere risikoen for misvisende resultater. Hver deltaker ble plassert på en kirurgisk seng i liggende stilling. Snittstedet ble desinfisert og en 10 ml xylocain 2%-ingen adrenalin ble injisert i området for snittet for lokalbedøvelse. Et snitt i hud og subkutant vev inntil fettvev ble avslørt, ble utført ca. 3-5 centimeter nær navlen mens snittlengden var ca. 2-2,5 centimeter. Deretter ble det subkutane vevet fjernet med en operasjonssaks og da fettvevet ble synlig ble nesten 500 milligram fettvev fanget opp og fjernet. Det oppsamlede fettvevet ble umiddelbart nedsenket i flytende nitrogen på -190° Celsius. For den endelige deponeringen ble prøvene plassert i Eppendorfs og de ble deponert i en fryser ved -80° Celsius frem til analyser.

UCP1 mRNA-analyse Etterforskerne som utførte gen- og proteinekspresjonsanalysene ble blindet for målet med studien. Totalt RNA ble ekstrahert fra fettvevsbiopsier ved bruk av RNeasy Lipid Tissue mini kit (QIAGEN) etter produsentens protokoll. Første-streng cDNA ble syntetisert fra like mengder totalt RNA ved bruk av tilfeldige primere og M-MLV revers transkriptase (Promega). Kvantitativ sanntids polymerasekjedereaksjon for UCP1-genet ble utført ved bruk av Sybr Green fluorofor. Endringen i fluorescens ved hver syklus ble overvåket og en terskelsyklus over bakgrunnen for hver reaksjon ble beregnet. En smeltekurveanalyse ble utført etter hver kjøring for å sikre et enkelt amplifisert produkt for hver reaksjon. Alle reaksjoner ble utført i minst duplikater for hver prøve. 18S rRNA-genet ble konstant uttrykt under alle eksperimentelle forhold og ble deretter brukt som et referansegen for normalisering gitt at dette genet ble foreslått som det mest passende for normalisering av UCP1 mRNA.

UCP1-proteinanalyse Subkutant fettvev ble homogenisert i RIPA Lysis Buffer med proteasehemmere (Sigma-Aldrich, Milano, Italia), sentrifugert ved 800 g i 10 minutter ved 4° Celsius og deretter ble det midterste laget samlet. Like mengder (50 mikrogram) proteiner ble separert på 10 % SDS-polyakrylamidgel, overført til en nitrocellulosemembran. UCP1 fra subkutane fettvevsprøver ble påvist av primære antistoffer, henholdsvis kanin polyklonalt anti-humant UCP1 (1:1000, Sigma-Aldrich, Milano, Italia) og muse monoklonalt anti-humant β-aktin (1:5000, Sigma-Aldrich, Milano, Italia). Sekundære antistoffer var peroksidase-konjugert anti-kanin IgG for UCP1 og anti-muse IgG for β-aktin. Humane adipocytter som ble behandlet med 100 uM mentol ble brukt som positive kontroller for UCP1-proteinekspresjon i henhold til tidligere metodikk. Western blotting-analyse ble utført ved bruk av Immobilion Western Chemiluminescent HRP Substrate (Millipore) og deteksjon ble gjort ved bruk av fotografiske filmer. Bildene er analysert ved densitometri, som evaluerer den relative mengden proteinfarging og kvantifiserer resultatene i form av optisk tetthet.

REE-vurderinger REE-vurderinger ble utført mellom 07.00 og 09.00 etter 12 timers faste, mens deltakerne avsto fra trening, alkohol og passiv røyking i 72 timer før målingene. REE ble målt ved hjelp av en automatisert gassanalysator (Vmax, CareFusion, USA) som ble festet til deltakerne for å registrere respirasjonsvariabler hvert 20. sekund i ryggleie i 30 minutter i et stille rom med 22-24° Celsius. Fra de 30 minuttene av de innsamlede dataene ble de første og siste fem minuttene fjernet. Til slutt ble gjennomsnittet av de resterende 20 minuttene av de innsamlede dataene for å oppnå den endelige REE-verdien (kalorier). Respirasjonsgassmålinger ble ekstrahert ved å bruke Weir-ligningen for å konvertere VO2- og VCO2-verdier til REE-verdier (kalorier). For å sikre nøyaktigheten av REE-målingene ble det gjennomsnittlige respirasjonsutvekslingsforholdet også verifisert i henhold til tidligere metodikk.

VO2peak og 1RM-vurderinger Ved baseline ble det utført en forhåndsscreening for hver deltaker for å identifisere deres kvalifikasjoner til å gjennomføre en VO2peak-test ved hjelp av Physical Activity Readiness Questionnaire. For å sikre deltakernes kjennskap til VO2peak-testen ble det gitt en detaljert verbal beskrivelse av protokollen på forhånd. Protokollen innebar en fem minutters oppvarming og en familiariseringsperiode for en sykling i en Monark Ergomedic 839E, Vansbro, Sverige. Følgelig innebar testen tre minutters tråkk med 60 omdreininger per minutt ved 60 watt etterfulgt av en økning på 30 watt/minutt inntil frivillig utmattelse. En automatisert gassanalysator (Vmax, CareFusion, USA) ble festet til deltakerne for å registrere respirasjonsvariabler hvert 20. sekund. Det høyeste oksygenopptaket (milliliter/minutt) for ethvert 20 sekunders intervall ble registrert som den endelige VO2-toppverdien.

1RM av benforlengelse og brystpress ble testet som følger: En passende vekt ble justert for hver deltaker for ikke å kunne løfte den i mer enn 10 repetisjoner. Antallet repetisjoner ble deretter beregnet og en norm ble brukt til å forutsi 1RM ved å bruke vekten i kilo som hver deltaker løftet og antall repetisjoner som ble utført.

Kostholdsvurdering Deltakerne ble tilfeldig kontaktet via telefon - av en uavhengig assistent som var blindet for målet med studien - på tre separate dager (to ukedager, en helgedag) i løpet av en ukesperiode for å fullføre en tre-dagers diettjournal. All mat og drikke som ble konsumert på kontaktdagen ble registrert. Tre-dagers diettopptegnelser ble samlet ved baseline, 8. og 16. uke av intervensjonen. Alle diettregistrene ble analysert av en annen utdannet assistent som ble blindet for målet med studien ved hjelp av Nutritionist Pro, versjon 5.4.0, Axxya Systems (Redmond, WA, USA). Denne programvaren (dvs. Nutritionist Pro) har tidligere blitt brukt til forskningsformål. For analysen ble det utført et søk i Nutritionist Pro for hver mat og drikke som ble konsumert. Detaljer om mengden og tilberedningen av hver mat og/eller drikke ble også inkludert. Når all relevant informasjon om maten eller drikken ble lagt inn i programvaren, ble en tilsvarende liste over makro- og mikronæringsinnhold gitt og deretter lagret. Denne prosessen ble gjentatt for all mat og drikke som er oppført i diettlisten. Hvis en bestemt mat eller drikke ikke ble funnet i Nutritionist Pro-databasen, la etterforskeren manuelt inn makro- og mikronæringsinnholdet i den aktuelle maten og lagret det i databasen for fremtidig bruk. Tilbakemeldingene fra programvaren for hver mat eller drikke inkluderte følgende kostholdsvariabler: totalt energiinntak (kalorier), vekt på mat (grammatikk), protein (grammatikk), karbohydrat (grammatikk), totalt fett (grammatikk), totalt sukker ( grammatikk) og koffein (mikrogrammatikk).