Влияние хронических упражнений на ген UCP1 в белой жировой ткани человека

Исследователи получили три (исходный уровень, после тренировки, после тренировки) биопсию подкожного жира у 32 здоровых мужчин, которые прошли три различных восьминедельных программы упражнений [аэробные (9 участников), сопротивление (8 участников), комбинированные (аэробные + сопротивление). , 8 участников)] и группа без упражнений (7 участников), после чего последовал восьминедельный период разминки. Интенсивность упражнений была установлена ​​на уровне 65% от пикового потребления кислорода (VO2peak) и 1 повторении максимума (1RM) в течение всего периода упражнений, в то время как содержание программ упражнений основано на предыдущем исследовании, в котором изучался ген PGC1a, который, как считается, увеличивает UCP1. в белой жировой ткани человека (WAT). Упражнения проводились в трех местных спортзалах в Трикале, Фессалия, Греция, каждое для каждой группы упражнений, чтобы избежать перекрестного заражения между участниками, в то время как руководители упражнений не знали цели исследования. Измерения антропометрии, состава тела, расхода энергии в покое (REE) и биопсии подкожного жира проводились в исходном состоянии, после тренировки (8-я неделя) и после разминки (16-я неделя), в то время как данные о диете собирались случайным образом в течение двух дней недели и один выходной день на исходном уровне, на 8-й и 16-й неделе. VO2peak и 1RM измерялись на исходном уровне, на 4-й неделе (для корректировки необходимой интенсивности упражнений на уровне 65%), на 8-й и 16-й неделе.

Антропометрия Участники посетили лабораторию с 07:00 до 09:00 и приняли участие в следующих антропометрических измерениях: рост измерялся с помощью устройства Seca (Гамбург, Германия), а вес измерялся с помощью весов (KERN & Sohn GmbH, версия 5.3, Германия). ), в то время как соотношение талии и бедер измерялось с помощью рулетки, а артериальное давление - акустическим методом с помощью сфигмоманометра Aneroid. Процент жира в организме и безжировую массу измеряли с помощью биоэлектрического импеданса с использованием монитора состава тела (Fresenius Medical Care AG & Co. KGaA D-61346 Bad Hamburg, Германия).

Жировая биопсия Все биопсии были выполнены опытным хирургом в соответствии с предыдущей методикой без использования диатермии. Участникам была проведена биопсия подкожной жировой клетчатки после как минимум восьмичасового голодания, и им было рекомендовано воздерживаться от физических упражнений, алкоголя и пассивного курения за 72 часа до процедуры биопсии, чтобы свести к минимуму риск ошибочных результатов. Каждый участник располагался на хирургической кровати в положении лежа на спине. Место разреза дезинфицировали и вводили 10 мл ксилокаина 2% без адреналина в область разреза для местной анестезии. Разрез кожи и подкожной клетчатки до выявления жировой ткани выполняли примерно в 3-5 сантиметрах рядом с пупком, при этом длина разреза составляла примерно 2-2,5 сантиметра. Впоследствии подкожная ткань была удалена операционными ножницами, и когда жировая ткань стала видимой, было захвачено и удалено около 500 миллиграммов жировой ткани. Собранную жировую ткань сразу же погружали в жидкий азот при температуре -190°С. Для окончательного осаждения образцы помещали в Eppendorfs и хранили в морозильной камере при -80°C до анализа.

Анализ мРНК UCP1 Исследователи, проводившие анализ экспрессии генов и белков, не знали цели исследования. Тотальную РНК экстрагировали из биоптатов жировой ткани с использованием мини-набора RNeasy Lipid Tissue mini (QIAGEN) в соответствии с протоколом производителя. кДНК первой цепи синтезировали из равных количеств тотальной РНК с использованием случайных праймеров и обратной транскриптазы M-MLV (Promega). Количественную полимеразную цепную реакцию в реальном времени для гена UCP1 проводили с использованием флуорофора Sybr Green. Отслеживали изменение флуоресценции в каждом цикле и рассчитывали пороговый цикл выше фона для каждой реакции. Анализ кривой плавления выполняли после каждого прогона, чтобы гарантировать наличие одного амплифицированного продукта для каждой реакции. Все реакции проводили как минимум в двух экземплярах для каждого образца. Ген 18S рРНК постоянно экспрессировался во всех экспериментальных условиях, а затем использовался в качестве эталонного гена для нормализации, учитывая, что этот ген был предложен как наиболее подходящий для нормализации мРНК UCP1.

Анализ белка UCP1 Подкожную жировую ткань гомогенизировали в лизисном буфере RIPA с ингибиторами протеазы (Sigma-Aldrich, Милан, Италия), центрифугировали при 800g в течение 10 минут при 4°С, а затем собирали средний слой. Равные количества (50 мкг) белков разделяли на 10% SDS-полиакриламидном геле, переносили на нитроцеллюлозную мембрану. UCP1 из образцов подкожной жировой ткани выявляли первичными антителами, соответственно кроличьими поликлональными антителами против человеческого UCP1 (1:1000, Sigma-Aldrich, Милан, Италия) и мышиными моноклональными антителами против человеческого β-актина (1:5000, Sigma-Aldrich, Италия). Милан, Италия). Вторичными антителами были конъюгированные с пероксидазой антикроличьи IgG для UCP1 и антимышиные IgG для β-актина. Адипоциты человека, обработанные 100 мкМ ментола, использовали в качестве положительных контролей экспрессии белка UCP1 в соответствии с предыдущей методикой. Вестерн-блоттинг выполняли с использованием Immobilion Western Chemiluminescent HRP Substrate (Millipore), а обнаружение проводили с использованием фотопленок. Изображения были проанализированы с помощью денситометрии, которая оценивает относительное количество окрашивания белка и дает количественную оценку результатов с точки зрения оптической плотности.

Оценки REE Оценки REE проводились с 07:00 до 09:00 после 12-часового голодания, в то время как участники воздерживались от физических упражнений, алкоголя и пассивного курения в течение 72 часов до измерений. РЗЭ измеряли с помощью автоматического газоанализатора (Vmax, CareFusion, США), который прикрепляли к участникам для регистрации респираторных параметров каждые 20 секунд в положении лежа на спине в течение 30 минут в тихой комнате при температуре 22-24°С. Из 30 минут собранных данных были удалены первые и последние пять минут. Наконец, оставшиеся 20 минут собранных данных усреднялись для получения окончательного значения РЗЭ (калорий). Измерения респираторного газа были извлечены с использованием уравнения Вейра для преобразования значений VO2 и VCO2 в значения РЗЭ (калории). Для обеспечения точности измерений РЗЭ средний коэффициент дыхательного обмена также был проверен в соответствии с предыдущей методикой.

Оценки VO2peak и 1RM На исходном уровне для каждого участника был проведен предварительный скрининг, чтобы определить их право на прохождение теста VO2peak с использованием Опросника готовности к физической активности. Для ознакомления участников с тестом VO2peak заранее было дано подробное словесное описание протокола. Протокол включал пятиминутную разминку и ознакомительный период езды на велосипеде на Monark Ergomedic 839E, Vansbro, Швеция. Следовательно, тест включал три минуты вращения педалей со скоростью 60 оборотов в минуту при мощности 60 Вт с последующим увеличением на 30 Вт/мин до произвольного истощения. К участникам присоединяли автоматический газоанализатор (Vmax, CareFusion, США) для регистрации респираторных переменных каждые 20 секунд. Максимальное поглощение кислорода (миллилитров/минуту) за любой 20-секундный интервал регистрировали как конечное значение VO2peak.

1ПМ разгибания ног и жима от груди проверялись следующим образом: каждому участнику подбирался подходящий вес, чтобы он не мог поднять его не более чем в 10 повторениях. Затем было рассчитано количество повторений, и использовалась норма для прогнозирования 1ПМ с использованием веса в килограммах, который поднял каждый участник, и количества выполненных повторений.

Оценка диеты С участниками случайным образом связывался по телефону независимый ассистент, который не знал цели исследования, в три отдельных дня (два будних дня, один выходной день) в течение недели для завершения трехдневной записи диеты. Все продукты питания и напитки, потребляемые в день контакта, регистрировались. Записи о трехдневном рационе были собраны на исходном уровне, на 8-й и 16-й неделе вмешательства. Все записи о диетах были проанализированы другим обученным ассистентом, который не знал цели исследования с помощью программы Nutritionist Pro, версия 5.4.0. Axxya Systems (Редмонд, Вашингтон, США). Это программное обеспечение (т. Nutritionist Pro) ранее использовался в исследовательских целях. Для анализа был проведен поиск в Nutritionist Pro по каждому потребляемому продукту и напитку. Также были включены сведения о количестве и приготовлении каждого продукта питания и/или напитка. После того, как вся необходимая информация о еде или напитке была введена в программное обеспечение, был предоставлен и впоследствии сохранен соответствующий список содержания макро- и микроэлементов. Этот процесс был повторен для всех продуктов питания и напитков, перечисленных в протоколе диеты. Если определенный продукт питания или напиток не был найден в базе данных Nutritionist Pro, исследователь вручную вводил содержание макро- и микроэлементов в этом конкретном продукте и сохранял его в базе данных для использования в будущем. Обратная связь, предоставленная программным обеспечением для каждого продукта питания или напитка, включала следующие диетические переменные: общее потребление энергии (калории), вес пищи (грамматика), белок (грамматика), углеводы (грамматика), общее количество жиров (грамматика), общее количество сахара ( грамматики) и кофеин (микрограмматики).