Sikkerhets- og effektstudie av virusaktiverte drepeimmunceller (VAK) for ondartet pleural og peritoneal effusjon

Det er et stort antall immunceller i immuntoleransetilstand i tumormikromiljøet. Det teoretiske grunnlaget for denne kliniske studien er å bruke ultrafiolett inaktivert onkolytisk herpes simplex virus type 2 (UV-oHSV2) for å aktivere PBMC eller immunceller i immuntoleransetilstand i ondartet pleura- og peritonealvæske in vitro, og for å transfusjonere de aktiverte immuncellene tilbake. til pasientens perifere blod eller pleura- og peritonealvæske for å drepe tumorceller i ondartet pleura- og peritonealvæske for ytterligere å kontrollere volumet av ondartet pleura- og peritonealvæske.

Vår studie indikerte at UV-oHSV2 potent aktiverte humane perifere blodmononukleære celler som førte til økt antitumoraktivitet in vitro og in vivo. Vi fant også at UV-oHSV2 kunne indusere NK-celler (isolert fra friske donors PBMC eller pasient pleural effusjon) proliferasjon, sekresjon av IFN-γ. Vi fant videre at UV-oHSV2 kunne forbedre NK-celler (isolert fra sunn PBMC eller pasient pleural effusjon) antitumorevne in vitro og in vivo.

Basert på forskningen ovenfor, gjennomførte vi en åpen, enkeltsenter, prospektiv klinisk studie for å evaluere sikkerheten og effektiviteten til VAK-celler i behandlingen av ondartede pleurale og peritoneale effusjoner.

Den detaljerte protokollen som følger:

Isolering av lymfocytter fra pasientens pleurale effusjoner eller ascites:

1. Tilsett pleuravæske i et 50 ml sentrifugerør, sentrifuger ved 400 g og kast supernatanten.
2. Resuspender bunnfallet med 40 ml vanlig saltvann og passer gjennom 70 μ M U.M og skyll deretter cellefilteret en gang med 5 ml fysiologisk saltvann.
3. Kast cellefilteret, og sentrifuger den filtrerte cellesuspensjonen i sentrifugerøret ved 400 g i 5 minutter. Etter sentrifugering, kast supernatanten og resuspender cellepelleten med 5 ml vanlig saltvann.
4. Bland Ficoll opp ned før bruk, ta et nytt 15ml sentrifugerør og tilsett 5ml Ficoll (sug med sprøyte).
5. Tilsett forsiktig 5-6 ml cellesuspensjon på Ficoll-laget.
6. Sentrifuger 400 g, 30-40 min, 18 ℃ - 20 ℃, sentrifugen må heves og senkes sakte, og innstillingen for plutselig stoppbremsing skal lukkes.
7. Ta det midterste hvite membranlaget (lymfocytter) inn i et nytt sentrifugerør.
8. Tilsett 3 ganger volumet av normalt saltvann til de absorberte lymfocyttene, resuspender cellene, sentrifuger 400-500 g, 10-15 minutter, 18 ℃ - 20 ℃.
9. Gjenta vask en gang, og det endelige bunnfallet resuspenderes med 5 ml serumfritt medium (RPMI1640).
10. Ta 20 μL cellesuspensjon i EP-rør, tilsett like volum trypanblått fargeløsning, blås forsiktig og tell med celleteller.
11. I prosessen med å plante de isolerte immuncellene ble cellekulturtettheten kontrollert innenfor området 106, og 10 % autolog plasma ble tilsatt.
12. Ta 4 ml cellesuspensjon for separat kultur, og tilsett den tilsvarende mengden inaktivert virus til den gjenværende cellesuspensjonen med infeksjonsnummeret MOI = 1. Beregningsformelen er som følger: volum uv-oh2 tilsatt = (1 × antall celler tilsatt per brønnplate eller flaske / oh2 virustiter)
13. Etter at immuncellene er plantet, plasseres de i en 5% CO2-inkubator i 36-48 timer.

Etter cellekultur ble 30-50 ml preparerte lymfocytter (kvalifisert ved PCR-sterilitetstest og endotoksintest) infundert i brystet og bukhulen til pasienten.