Stabilizacja HIF-1α jako nowe podejście terapeutyczne w przypadku sarkopenii. (HIF2)

Kluczową rolę, jaką odgrywa czynnik 1α indukowany hipoksją (HIF-1α) podczas miogenezy, wykazano w dwóch ostatnich publikacjach grupy zwolenników (Cirillo i in., 2017a; Cirillo i in., 2020). W szczególności wykazano, że proliferujące mysie mioblasty traktowane przez 24 godziny w warunkach 1% O2 (niedotlenienie) w pożywce wzrostowej, a następnie stymulowane do różnicowania przez 7 dni w warunkach normoksycznych (21% O2) wykazały tworzenie przerośniętych miotubul o stężeniu 1,4- krotny wzrost wskaźnika różnicowania w porównaniu z normoksyczną grupą kontrolną. Wyniki te potwierdzono analizą kluczowych markerów różnicowania. W szczególności, mioblasty poddane działaniu niedotlenienia wykazywały odpowiednio 3-, 2,4- i 1,33-krotny wzrost lokalizacji jądrowej MyoD, ekspresji miogeniny po 3 dniach różnicowania i ekspresji MHC na końcu procesu różnicowania w porównaniu z kontrolami. Co więcej, potwierdziliśmy te wyniki w biopsjach mięśni szkieletowych pobranych od starszych pacjentów z sarkopenią w porównaniu z biopsjami pobranymi od młodych osób. Stwierdziliśmy spadek ekspresji HIF-1α i jego genów docelowych w sarkopenii, a także PAX7, głównego markera komórek macierzystych komórek satelitarnych, podczas gdy podwyższony został marker atrofii MURF1. Wyizolowaliśmy także komórki satelitarne z biopsji mięśni i hodowaliśmy je in vitro. Odkryliśmy, że farmakologiczna aktywacja HIF-1α i jego genów docelowych spowodowała zmniejszenie zaniku mięśni szkieletowych i aktywację ekspresji genu PAX7. Podsumowując, w tej pracy odkryliśmy, że HIF-1α odgrywa rolę w sarkopenii i bierze udział w homeostazie komórek satelitarnych (Cirillo i in., 2022).

Biorąc pod uwagę nasze wstępne dane, pierwsza część naszego projektu skupi się na rekrutacji pacjentów i charakterystyce klinicznej. W szczególności analizy zostaną przeprowadzone w dwóch odrębnych grupach: grupie sarkopenicznej, składającej się z 60 pacjentów dotkniętych sarkopenią zgodnie z najnowszymi wytycznymi (> 65 lat) oraz grupie kontrolnej, składającej się z 45 pacjentów bez sarkopenii (w wieku od 18 i 35 lat). Badanie zostanie przeprowadzone zgodnie z zasadami szpitalnej komisji etyki, a pacjenci będą zobowiązani do podpisania formularza świadomej zgody na udział w badaniu. Pacjenci będą rekrutowani na 24 miesiące, z czego 6 miesięcy będzie dostępnych na analizę danych. Rekrutacja będzie odbywać się podczas rutynowych badań ortopedycznych w IRCCS Istituto Ortopedico Galeazzi u pacjentów zakwalifikowanych do zabiegów ortopedycznych (wymiana stawu biodrowego z powodu choroby zwyrodnieniowej stawów, złamania bliższej części kości udowej, operacja rekonstrukcyjna ALC). Z badania zostaną wykluczeni pacjenci z chorobami współistniejącymi, w tym sarkopenią związaną z otyłością i cukrzycą. Wszyscy pacjenci zostaną poddani (a) badaniu całego ciała DXA, które umożliwia ilościowe określenie trzech składników ciała: minerałów kostnych, tłuszczu i masy wolnej od minerałów kości, (b) ręcznej dynamometrii w celu oceny siły chwytu oraz (c) analizie antropometrycznej (BMI) w celu oszacowania tkanki tłuszczowej. Zostanie pobrana próbka krwi w celu określenia stopnia sarkopenii za pomocą analizy serologicznej. Obejmuje to pomiar aminoterminalnego propeptydu prokolagenu typu III (P3NP), c-końcowego fragmentu agryny 22 (CAF22), osteonektyny, iryzyny, białka wiążącego kwasy tłuszczowe 3 (FABP3) i czynnika hamującego migrację makrofagów (MIF), który są uważane za główne biomarkery sarkopenii (Nogueira i in., 2019; Qaisar i in., 2020). Po rekrutacji pacjentów celem badania będzie identyfikacja zmian w sygnalizacji HIF-1alfa podczas sarkopenii. W szczególności od grup sarkopenicznych i kontrolnych pobrane zostaną liczne biopsje mięśni szkieletowych, zwykle odrzucane podczas operacji, w celu opracowania metod multiomicznych i testów histologicznych. W szczególności białka całkowite zostaną wyekstrahowane z próbki mięśni szkieletowych w celu przeprowadzenia analiz proteomu w oparciu o spektrometrię mas i test bioenergetycznego metabolizmu komórkowego przy użyciu analizy metabolizmu komórek w czasie rzeczywistym Seahorse w naszym laboratorium. Analiza statystyczna danych dotyczących proteomu i metabolomu skupi się na zmianach w powiązaniu między sygnalizacją HIF a aktywnością mitochondriów. Wyniki proteomu zostaną technicznie potwierdzone metodą Western blot z użyciem specyficznych przeciwciał. Uwzględnione zostaną tylko białka wykazujące rzeczywistą różnicę w ekspresji wynoszącą co najmniej 0,6. Z drugiej strony biopsje mięśni szkieletowych będą również wykorzystywane do badania histologicznego. Główny nacisk zostanie położony na 1) aktywację komórek satelitarnych przez specyficzne przeciwciało PAX7, 2) ilościowe oznaczenie zaniku mięśni szkieletowych przez specyficzne przeciwciało MuRF1, 2) oraz zmiany w składzie włókien mięśniowych przy użyciu specyficznych przeciwciał skierowanych przeciwko łańcuchowi ciężkiemu miozyny typu I, IIA i IIB.