Wpływ niechirurgicznej terapii periodontologicznej na poziom interleukiny-21 w płynie dziąsłowym

Wstęp

Choroba przyzębia jest chorobą wielobakteryjną, która atakuje tkanki podtrzymujące zęby. Integralną częścią choroby przyzębia jest niszczenie tkanek przyzębia, które wynika ze stymulacji bakteryjnej prowokacji odpowiedzi immunologicznej gospodarza. Przewlekłe zapalenie przyzębia jest najczęstszą postacią choroby przyzębia w populacji osób dorosłych. Biofilm płytki bakteryjnej jest pierwotnym czynnikiem zapalenia przyzębia, ale większość zniszczeń tkanek przyzębia ostatecznie kończy się sekwencją reakcji immunologicznych i zapalnych. W wyniku aktywacji komórkowej, mediatory zapalne obejmują cytokiny, chemokiny itp. wspólnie przyczyniają się do niszczenia tkanek i resorpcji kości. Cytokiny można podzielić na Th1, Th2, Th17 i T regulatorowe (Treg) w oparciu o ich wzorzec ekspresji i wpływ na docelowe komórki lub tkanki.5 Klasycznie choroby przyzębia wyjaśniano szlakiem Th1/Th2. Komórki Th1 są częściej wykrywane we wczesnym stadium zmian przyzębia, co sugeruje, że komórki Th1 są związane z odpowiedzią ochronną przed infekcją bakteryjną, podczas gdy komórki Th2 dominują w późniejszym i zaawansowanym okresie choroby, odgrywając rolę w niszczeniu i progresji przyzębia uszkodzenia. Alternatywny typ odpowiedzi gospodarza na bakterie chorobotwórcze został opisany przez szlak IL-23/IL-17. Ten alternatywny szlak występuje, gdy bakterie indukują syntezę IL-23/17 zamiast IL-12, która odgrywa kluczową rolę w inicjowaniu i utrzymywaniu odpowiedzi zapalnej. Szlak IL-23/17 w porównaniu z klasycznym szlakiem Th1/Th2 jest bardzo dobrze dostrojoną komórkową odpowiedzią immunologiczną, która ma wiele funkcji, które łączą wrodzone i adaptacyjne ramię odpowiedzi immunologicznej.9 Cytokiny Th17 (IL-17, IL-21, IL-22, IL-6, czynnik martwicy nowotworu {TNF}-a itp.)8 uczestniczą w chorobach przyzębia, ale wątpliwa jest ich dominująca rola w ochronie gospodarza lub niszczeniu . Te cytokiny nie zostały wyjaśnione w różnych stanach zapalnych w zapaleniu przyzębia.

IL-21 jest cytokiną typu I, strukturalnie wydaje się podobna do białek IL-2, IL-4 i IL-15. IL-21 składa się głównie z aktywowanych limfocytów T, ale kieruje szerokim spektrum komórek mieloidalnych i limfoidalnych układu odpornościowego, które ułatwiają IL-21 modulowanie nabytej i wrodzonej odporności.10 IL-21 konkuruje w odporności przeciwko komórkom nowotworowym11 i przewlekłym infekcjom wirusowym,12 jednak ogromne osiągnięcia IL-21 zostały skorelowane z rozwojem immunologicznych chorób zapalnych w różnych narządach.13 IL-21 jest podwyższony w stanach dermatologicznych, takich jak biopsje skóry14 pacjentów z toczniem rumieniowatym układowym, łuszczycą i atopowym zapaleniem skóry. Ponadto interpretacja IL-21 odpowiada obecności komórek Th17 w płynie maziowym i krwi obwodowej pacjentów z reumatoidalnym zapaleniem stawów.

Rola IL-21 w stanach zapalnych była szeroko badana; aspekt leczenia dotyczący jego poziomów w chorobach przyzębia wymaga dalszych badań. Dlatego w świetle powyższych ustaleń badacze określają poziomy interleukiny-21 (IL-21) w GCF z przewlekłego zapalenia dziąseł, przewlekłego zapalenia przyzębia i pacjentów kontrolnych przed i po niechirurgicznym leczeniu przyzębia wraz z korelacją kliniczne parametry destrukcji tkanek przyzębia.

MATERIAŁ I METODY:

PACJENCI:

Trzydziestu czterech pacjentów (19 mężczyzn i 15 kobiet, w wieku 20-60 lat) zostało włączonych kolejno przez okres sześciu miesięcy (od kwietnia 2014 do września 2014) z ambulatoryjnego oddziału periodontologii Krishnadevaraya College of Dental Sciences, Bangalore i Karnataka. Zgodę etyczną dla badania uzyskano od instytucjonalnej komisji etycznej (02-D012-36773). Badanie zostało przeprowadzone zgodnie z zasadami etycznymi opisanymi w Deklaracji Helsińskiej 2008. Wyjaśniono procedurę badania i uzyskano świadomą pisemną zgodę wszystkich uczestników przed włączeniem ich do badania. Wśród nich 24 pacjentów z chorym przyzębiem podzielono na 12 pacjentów z przewlekłym zapaleniem dziąseł i 12 pacjentów z przewlekłym zapaleniem przyzębia, podczas gdy 10 osób zdrowych stanowiło grupę kontrolną. Kryteriami włączenia byli: pacjenci posiadający co najmniej 14 zębów czynnych, pacjenci ogólnie zdrowi, którzy nie otrzymywali żadnej formy chirurgicznego i niechirurgicznego leczenia periodontologicznego lub otrzymywali antybiotyki lub niesteroidowe leki przeciwzapalne w ciągu ostatnich 6 miesięcy badania . Przewlekłe zapalenie dziąseł zdefiniowano jako głębokość sondowania (PD) mniejszą lub równą 4 mm i większą niż 25% miejsc z obecnym krwawieniem dziąseł (BOP).15 Przewlekłe zapalenie przyzębia zdefiniowano jako mające głębokość zgłębnika większą lub równą 5 mm, RAL większą lub równą 8 mm, z więcej niż lub równym 10% miejsc z dodatnim wynikiem BOP i oznakami utraty masy kostnej stwierdzonej radiologicznie.16 Pacjenci, którzy zgłosili się na ochotnika bez objawów choroby przyzębia stwierdzonej brakiem podwyższonego PD lub AL, zostali uznani za zdrową grupę kontrolną.

Pomiary kliniczne:

Parametry kliniczne zmierzono i oceniono dla wszystkich zębów z wyjątkiem trzecich zębów trzonowych, we wszystkich sześciu miejscach każdego zęba (mezjalno-policzkowa, dystalno-policzkowa, dystalno-językowa, środkowo-językowa i mezjalno-językowa). Parametry te obejmowały głębokość kieszonek (PD), ocenę krwawienia dziąseł, tj. wskaźnik dziąseł (GI), dychotomiczny pomiar gromadzenia się płytki nazębnej naddziąsłowej, tj. wskaźnik płytki nazębnej (PI), oraz krwawienie przy sondowaniu (BOP) do podstawy szczeliny. Jeden skalibrowany egzaminator (MN) wykonał wszystkie oceny i pomiary pacjenta.

Pobieranie i analiza próbek GCF:

We wszystkich trzech grupach próbki GCF pobrano na początku badania i 6 tygodni po leczeniu. Wyboru miejsca dokonano na podstawie najwyższej punktacji zarejestrowanej dla pojedynczego miejsca w jamie ustnej. U każdego pacjenta wybrano jedno miejsce, które wykazywało najgorsze objawy zapalne (przewlekłe zapalenie dziąseł) i najwyższy poziom RAL (przewlekłe zapalenie przyzębia) do pobrania płynu dziąsłowego. W naszym badaniu wybraliśmy jedno miejsce u każdego pacjenta, aby uniknąć łączenia próbek z wielu miejsc, ponieważ zapalenie przyzębia jest chorobą specyficzną dla danego miejsca. Przed pobraniem próbek GCF naddziąsłową płytkę nazębną usunięto za pomocą wacików unikając kontaktu z dziąsłem brzeżnym. Standardowe paski papieru ostrożnie wprowadzono na głębokość około 2 mm do bruzdy/kieszonki na 30 sekund w celu zebrania GCF. Paski zanieczyszczone krwią odrzucono i wykorzystano miejsce alternatywne w celu uzyskania próbek zastępczych. W przypadku pacjentów z przewlekłym zapaleniem dziąseł pobrano alternatywne próbki z kolejnymi najwyższymi wynikami GI, aw przypadku pacjentów z przewlekłym zapaleniem przyzębia wybrano następną najgłębszą głębokość kieszonki sondującej {PPD} jako alternatywne miejsce pobrania próbki. Skalibrowane urządzenie zastosowano do ilościowego określenia objętości próbki GCF, a odczyty przeliczono na rzeczywistą objętość (μl) w odniesieniu do krzywej wzorcowej, przygotowanej przy użyciu odczytu periotronowego objętości płynu (μl) destylowanej wody w paskach perio-col. Pusty pasek do zbierania płynu dziąsłowego (perio-col) umieszczono między metaczujnikami płynu periotronowego, a instrument ustawiono tak, aby wyświetlał odczyt zerowy. Mikrolitrową strzykawkę użyto do dokładnego podania 0,25-1,25 μl płynu (wody destylowanej) na pasek perio-col. Paski natychmiast umieszczono między czujnikami periotronowymi. Objętość punktowa periotronu wyświetlała zarejestrowaną znaną objętość płynu. Ten krok powtórzono jeszcze trzy razy z 0,25 μl płynu testowego i zarejestrowano średni wynik. Powyższy krok powtórzono stosując objętości 0,5, 0,75, 1,0, 1,25 µl iw każdym przypadku obliczono i zarejestrowano średnią wartość periotronową. Po uzyskaniu wszystkich punktów obliczono krzywą standardową ze znaną objętością płynu (oś X) i wynikiem periotronowym (oś Y). W podobny sposób objętości GCF (ze stanu zdrowia, przewlekłego zapalenia dziąseł, przewlekłego zapalenia przyzębia) od badanych pacjentów uzyskano automatycznie z oceną periotronową. Interpolacja ze standardowego wykresu kalibracyjnego dała objętość płynu. Po zmierzeniu objętości paski z wybranych miejsc natychmiast umieszczono w poszczególnych probówkach mikrowirówkowych zawierających 200 μl roztworu buforu fosforanowego. Próbki przechowywano w temperaturze -80°C do czasu dalszej analizy.

ELIZA

Poziomy IL-21 w GCF określono za pomocą testu ELISA zgodnie z instrukcją producenta. Aby eluować białka, probówki zawierające paski periopapieru worteksowano i homogenizowano przez 30 sekund, a następnie wirowano przy 12500 obr./min w 4°C przez 5 minut. W zestawie wykorzystano przeciwciało monoklonalne MT 21.3, biotynę oraz ludzki standard rekombinowanej IL-21 (przeciwciało wychwytywane). Próbki przeprowadzono w trzech powtórzeniach, aby potwierdzić czułość testu ELISA i stwierdzono, że wszystkie próbki mieściły się w granicy wykrywalności testu ELISA. Do pomiaru absorbancji substratu użyto czytnika ELISA (czytnik mikropłytek sorbancji Spectramax 190 Ab; urządzenia molekularne; Sunnyvale, CA, USA) z 450 nm jako elementarną długością fali. Konwersję uzyskanych odczytów absorbancji na określoną objętość (pg/ml) przeprowadzono stosując wzorcową krzywą odniesienia. Stężenie białka w każdym miejscu (pg/ml) określono dzieląc całkowitą ilość IL-21 (pg) przez objętość płynu dziąsłowego (μl), a następnie wartości (pg/μl) przeliczono na (pg/ml) .

Protokoły leczenia periodontologicznego:

Na początku badania wykonano parametry kliniczne i pobrano próbki GCF od wszystkich pacjentów. Wszyscy pacjenci otrzymali dokładny instruktaż higieny jamy ustnej, pełne skalingowanie naddziąsłowe poddziąsłowe wraz z wygładzeniem korzeni. Niechirurgiczne leczenie periodontologiczne grupy III przeprowadzono na 2-3 wizytach. Pojedynczy skalibrowany egzaminator (MN) zapewniał leczenie wszystkim badanym pacjentom.

ANALIZA STATYSTYCZNA:

Moc badania i obliczenie liczebności próby określono na podstawie zmiany poziomu GCF IL-21. Bieżące szacunki jako badanie pilotażowe, które obejmowało 12 pacjentów w każdej grupie testowej i 10 w grupie kontrolnej o łącznej wielkości próby 34 pacjentów. Obliczono poziom błędu II rodzaju β = 0,20 (moc 80%) oraz poziom błędu I rodzaju α=0,05 (prawdopodobieństwo 5%). Rozkład próbek z odpowiednimi wartościami poziomów PI, GI, BOP, PD, RAL i IL-21 przed i po operacji poddano analizie statystycznej. Dane wprowadzono do programu Microsoft Excel i przeanalizowano za pomocą pakietu SPSS {statistical package for social science}, ver.10.05). Proporcje porównano za pomocą testu istotności chi-kwadrat (χ2). Normalność danych zbadano testem Shapiro-Wilka. Przeprowadzono test t-Studenta w celu określenia wartości różnic przed i po leczeniu. Do zbadania różnicy między grupami zastosowano jednokierunkową analizę wariancji (ANOVA). Porównanie parametrów biochemicznych i klinicznych przeprowadzono za pomocą nieparametrycznego testu Kruskala-Wallisa. P<0,05 uznano za statystycznie istotne.