Efeito da terapia periodontal não cirúrgica nos níveis de interleucina-21 do fluido crevicular gengival

Introdução

A doença periodontal é uma doença polimicrobiana que afeta os tecidos de suporte dos dentes. Parte integrante da doença periodontal envolve a destruição dos tecidos periodontais que resulta da estimulação do desafio bacteriano para hospedar a resposta imune-inflamatória. A periodontite crônica é a forma mais comum de doença periodontal na população adulta. O biofilme da placa bacteriana é o fator primitivo para a periodontite, mas a maior parte da destruição dos tecidos periodontais acabaria por resultar de uma sequência de reações imunoinflamatórias. Como resultado da ativação celular, os mediadores inflamatórios incluem citocinas, quimiocinas, etc. Contribuem coletivamente para a destruição tecidual e reabsorção óssea. As citocinas podem ser agrupadas como Th1, Th2, Th17 e T reguladoras (Treg) com base em seu padrão de expressão e efeitos nas células ou tecidos-alvo.5 Classicamente, a doença periodontal tem sido explicada pela via Th1/Th2. As células Th1 são mais frequentemente detectadas na fase inicial das lesões periodontais, sugerindo que as células Th1 estão associadas a uma resposta protetora contra a infecção bacteriana, enquanto as células Th2 predominam no período tardio e avançado da doença, tendo um papel na destruição e progressão da doença periodontal. lesões. Um tipo alternativo de resposta do hospedeiro a bactérias patogênicas foi descrito pela via IL-23/IL-17. Esta via alternativa ocorre quando as bactérias induzem a síntese de IL-23/17 em vez de IL-12, que desempenha um papel fundamental na iniciação e manutenção da resposta inflamatória. A via IL-23/17, em comparação com a via Th1/Th2 clássica, é uma resposta imune celular muito bem ajustada que tem uma infinidade de funções que ligam o braço inato e adaptativo da resposta imune.9 As citocinas Th17 (IL-17, IL-21, IL-22, IL-6, fator de necrose tumoral {TNF}-a, etc.)8 participam da doença periodontal, mas se seu papel dominante é protetor do hospedeiro ou destrutivo é questionável . Essas citocinas não foram elucidadas em diferentes estados inflamatórios na periodontite.

A IL-21 é uma citocina tipo I, estruturalmente semelhante às proteínas IL-2, IL-4 e IL-15. A IL-21 é composta principalmente por células T ativadas, mas dirige um vasto espectro de células mielóides e linfóides do sistema imunológico, que facilitam a IL-21 para modular a imunidade adquirida e inata.10 A IL-21 compete na imunidade contra células tumorais11 e infecções virais crônicas,12 no entanto, enorme realização de IL-21 tem sido correlacionada com o avanço de doenças inflamatórias imunes em vários órgãos.13 A IL-21 está aumentada em condições dermatológicas como biópsias de pele14 de pacientes com lúpus eritematoso sistêmico, psoríase e dermatite atópica. Além disso, a interpretação de IL-21 corresponde à presença de células Th17 no líquido sinovial e no sangue periférico de pacientes com artrite reumatoide.

O papel da IL-21 na inflamação foi extensivamente estudado; o aspecto do tratamento em seus níveis em doenças periodontais precisa ser mais explorado. Portanto, à luz dos achados acima, os investigadores determinam os níveis de interleucina-21 (IL-21) em GCF de gengivite crônica, periodontite crônica e pacientes de controle antes e depois da terapia periodontal não cirúrgica, juntamente com a correlação de parâmetros clínicos da destruição dos tecidos periodontais.

MATERIAL E MÉTODOS:

PACIENTES:

Trinta e quatro pacientes (19 homens e 15 mulheres, com idades entre 20 e 60 anos) foram inscritos consecutivamente durante um período de seis meses (abril de 2014 a setembro de 2014) do departamento ambulatorial de periodontologia, Krishnadevaraya College of Dental Sciences, Bangalore e Karnataka. A autorização ética para o estudo foi obtida do comitê de ética institucional (02-D012-36773). O estudo foi conduzido de acordo com os princípios éticos descritos na Declaração de Helsinki 2008. O procedimento do estudo foi explicado e o consentimento informado por escrito foi obtido de todos os participantes antes de sua inclusão no estudo. Entre eles, 24 pacientes com doença periodontal foram agrupados em 12 pacientes com gengivite crônica e 12 pacientes com periodontite crônica, enquanto 10 indivíduos saudáveis ​​foram incluídos como controle. Os critérios de inclusão foram: pacientes com mais ou igual a 14 dentes funcionais, pacientes sistemicamente saudáveis ​​que não receberam nenhuma forma de terapia periodontal cirúrgica e não cirúrgica ou receberam antibióticos ou terapia anti-inflamatória não esteróide nos últimos 6 meses do estudo . A gengivite crônica foi definida como tendo profundidade de sondagem (PD) menor ou igual a 4 mm e mais de 25% dos locais com sangramento gengival presente (BOP).15 A periodontite crônica foi definida como tendo profundidade de sondagem maior ou igual a 5 mm, RAL maior ou igual a 8 mm, com mais ou igual a 10% de locais com BOP positivo e evidência de perda óssea determinada radiograficamente.16 Os pacientes que se voluntariaram sem evidência de doença periodontal determinada pela ausência de aumento de DP ou AL foram considerados como grupo controle saudável.

Medidas clínicas:

Os parâmetros clínicos foram medidos e avaliados para todos os dentes, excluindo os terceiros molares, em todos os seis locais para cada dente (mésio-vestibular, disto-vestibular, disto-lingual, médio-lingual e mésio-lingual). Esses parâmetros consistiam na profundidade da bolsa (PD), avaliação do sangramento gengival, ou seja, índice gengival (GI), medição dicotômica do acúmulo de placa supragengival, ou seja, índice de placa (PI) e sangramento à sondagem (BOP) na base do sulco. Um examinador calibrado (MN) realizou todas as avaliações e medições do paciente.

Coleta e análise de amostras GCF:

Em todos os três grupos, as amostras GCF foram coletadas no início e 6 semanas após o tratamento. A seleção do local foi baseada na pontuação mais alta registrada para um único local na cavidade oral. Um único local em cada indivíduo que apresentou as piores manifestações inflamatórias (gengivite crônica) e o nível mais alto de RAL (periodontite crônica) foi selecionado para coleta de fluido crevicular gengival. Em nosso estudo, selecionamos um único local em cada indivíduo para evitar o agrupamento de amostras de vários locais, pois a periodontite é uma doença específica do local. Antes da coleta das amostras GCF, a placa supragengival foi removida com bolinhas de algodão evitando o contato com a gengiva marginal. Tiras de papel padrão foram cuidadosamente inseridas a uma profundidade de aproximadamente 2mm, no sulco/bolsa por 30 segundos para coleta do GCF. Tiras contaminadas com sangue foram descartadas e local alternativo foi usado para obter amostras de substituição. Em pacientes com gengivite crônica, amostras alternativas foram coletadas com os próximos escores GI mais altos e em pacientes com periodontite crônica, a próxima profundidade de bolsa de sondagem {PPD} mais profunda foi selecionada para o local de amostra alternativo. Um aparelho calibrado foi usado para quantificar o volume da amostra GCF e as leituras foram convertidas para o volume real (μL) por referência a uma curva padrão, preparada usando a leitura do periotron do volume de fluido (μL) de água destilada em tiras de perio-col. Uma tira de coleta de fluido gengival em branco (perio-col) foi colocada entre os meta-sensores de fluido periotron e o instrumento foi ajustado para exibir uma leitura de zero. Uma seringa de microlitro foi usada para fornecer com precisão 0,25-1,25 μL de fluido (água destilada) para a tira de perio-col. As tiras foram imediatamente colocadas entre os sensores periotron. O volume de pontuação do periotron exibiu o volume conhecido de fluido registrado. Esta etapa foi repetida mais três vezes com 0,25 μL de fluido de teste e a pontuação média registrada. A etapa acima foi repetida usando o volume de 0,5, 0,75, 1,0, 1,25 μL e, em todos os casos, o valor médio do periotron calculado e registrado. Uma vez que todos os escores foram obtidos, uma curva padrão foi computada com volume de fluido conhecido (eixo X) e escore periotron (eixo Y). De maneira semelhante, os volumes GCF (da saúde, gengivite crônica, periodontite crônica) dos pacientes do estudo foram obtidos automaticamente com a pontuação do periotron. A interpolação do gráfico de calibração padrão forneceu o volume de fluido. Após a medição do volume, as tiras dos locais selecionados foram colocadas imediatamente em tubos individuais de microcentrífuga contendo 200 μL de solução tampão fosfato. As amostras foram armazenadas a -80 °C até análise posterior.

ELISA

Os níveis de IL-21 no GCF foram determinados usando ELISA de acordo com as instruções do fabricante. Para a eluição das proteínas, os tubos contendo as tiras de periopaper foram agitados em vortex e homogeneizados por 30 segundos e então centrifugados a 12.500 rpm a 4°C por 5 minutos. O kit utilizou anticorpo monoclonal MT 21.3 biotina e padrão humano recombinante IL-21 (anticorpo capturado). As amostras foram processadas em triplicado para autenticar a sensibilidade do ELISA e todas as amostras estavam dentro do limite de detecção do ELISA. Um leitor de ELISA (leitor de microplacas de absorção Spectramax 190 Ab; dispositivos moleculares; Sunnyvale, CA, EUA) com 450 nm como comprimento de onda elementar foi usado para medir a absorção do substrato. A conversão das leituras de absorbância obtidas, em volume definido (pg/mL) foi realizada utilizando curva padrão de referência. A concentração de proteína em cada local (pg/mL) foi determinada dividindo a quantidade total de IL-21 (pg) pelo volume de fluido crevicular gengival (μL) e posteriormente os valores (pg/μL) foram convertidos em (pg/mL) .

Protocolos de tratamento periodontal:

No início do estudo, parâmetros clínicos e coleta de amostras GCF para todos os pacientes foram feitos. Todos os pacientes receberam instruções completas de higiene oral, uma raspagem subgengival supragengival da boca completa, juntamente com alisamento radicular. A terapia periodontal não cirúrgica para o grupo III foi realizada em 2-3 consultas. Um único examinador calibrado (MN) forneceu tratamento a todos os pacientes do estudo.

ANÁLISE ESTATÍSTICA:

O poder do estudo e o cálculo do tamanho da amostra foram determinados com base na mudança no nível de GCF IL-21. Estimativas atuais como um estudo piloto que incluiu 12 pacientes em cada grupo de teste e 10 no grupo de controle com tamanho total da amostra de 34 pacientes. Foi calculado o nível de erro tipo II de β = 0,20 (80% de poder) e o nível de erro tipo I de α = 0,05 (5% de probabilidade). A distribuição das amostras com os respectivos valores de PI, GI, BOP, PD, RAL e IL-21 no pré e pós-operatório foi analisada estatisticamente. Os dados foram inseridos no Microsoft Excel e analisados ​​usando o pacote SPSS (pacote estatístico para ciências sociais}, ver.10.05). As proporções foram comparadas usando o teste Qui-quadrado (χ2) teste de significância. A normalidade dos dados foi testada por meio do teste de Shapiro-Wilk. Um teste t de Student foi realizado para determinar os valores de diferença pré e pós-tratamento. Uma análise de variância (ANOVA) foi usada para testar a diferença entre os grupos. A comparação dos parâmetros bioquímicos e clínicos foi realizada por meio do teste não paramétrico de Kruskal-Wallis. P<0,05 foi considerado estatisticamente significativo.