Effetto della terapia parodontale non chirurgica sui livelli di interleuchina-21 del fluido crevicolare gengivale

introduzione

La malattia parodontale è una malattia polimicrobica che colpisce i tessuti di sostegno dei denti. Parte integrante della malattia parodontale comporta la distruzione dei tessuti parodontali che risulta dalla stimolazione della sfida batterica per ospitare la risposta immuno-infiammatoria. La parodontite cronica è la forma più comune di malattia parodontale nella popolazione adulta. Il biofilm della placca batterica è il fattore primitivo della parodontite, ma la maggior parte della distruzione dei tessuti parodontali si concluderebbe con una sequenza di reazioni immuno-infiammatorie. Come risultato dell'attivazione cellulare, i mediatori dell'infiammazione includono citochine, chemochine, ecc. che contribuiscono collettivamente alla distruzione dei tessuti e al riassorbimento osseo. Le citochine possono essere raggruppate come regolatrici Th1, Th2, Th17 e T (Treg) in base al loro pattern di espressione e agli effetti sulle cellule o sui tessuti bersaglio.5 Classicamente, la malattia parodontale è stata spiegata dalla via Th1/Th2. Le cellule Th1 sono più frequentemente rilevate nella fase iniziale delle lesioni parodontali, suggerendo che le cellule Th1 sono associate a una risposta protettiva contro l'infezione batterica, mentre le cellule Th2 predominano nel periodo successivo e avanzato della malattia, avendo un ruolo nella distruzione e nella progressione della malattia parodontale. lesioni. Il tipo alternativo di risposta dell'ospite ai batteri patogeni è stato descritto dal percorso IL-23/IL-17. Questo percorso alternativo si verifica quando i batteri inducono la sintesi di IL-23/17 piuttosto che di IL-12, che svolge un ruolo fondamentale nell'avvio e nel mantenimento della risposta infiammatoria. Il percorso IL-23/17 rispetto al classico percorso Th1/Th2 è una risposta immunitaria cellulare molto finemente sintonizzata che ha una moltitudine di funzioni che collegano il braccio innato e adattativo della risposta immunitaria.9 Le citochine Th17 (IL-17, IL-21, IL-22, IL-6, fattore di necrosi tumorale {TNF}-a, ecc.)8 partecipano alla malattia parodontale, ma è discutibile se il loro ruolo dominante sia di protezione dell'ospite o distruttivo . Queste citochine non sono state chiarite a diversi stati infiammatori nella parodontite.

IL-21 è una citochina di tipo I, strutturalmente appare simile alle proteine ​​IL-2, IL-4 e IL-15. IL-21 è composto principalmente da cellule T attivate, ma dirige un vasto spettro di cellule mieloidi e linfoidi del sistema immunitario, che facilitano l'IL-21 a modulare l'immunità acquisita e innata.10 L'IL-21 compete nell'immunità contro le cellule tumorali11 e le infezioni virali croniche,12 tuttavia, l'enorme successo dell'IL-21 è stato correlato al progresso delle malattie infiammatorie immunitarie in vari organi.13 IL-21 è intensificato in condizioni dermatologiche come biopsie cutanee14 di pazienti con lupus eritematoso sistemico, psoriasi e dermatite atopica. Inoltre, l'interpretazione di IL-21 corrisponde alla presenza di cellule Th17 nel liquido sinoviale e nel sangue periferico dei pazienti affetti da artrite reumatoide.

Il ruolo dell'IL-21 nell'infiammazione è stato ampiamente studiato; l'aspetto del trattamento ai suoi livelli nelle malattie parodontali deve essere ulteriormente esplorato. Pertanto, alla luce dei risultati di cui sopra, i ricercatori determinano i livelli di interleuchina-21 (IL-21) in GCF da gengivite cronica, parodontite cronica e pazienti di controllo prima e dopo la terapia parodontale non chirurgica insieme alla correlazione di parametri clinici di distruzione dei tessuti parodontali.

MATERIALE E METODI:

PAZIENTI:

Trentaquattro pazienti (19 maschi e 15 femmine, di età compresa tra 20 e 60 anni) sono stati arruolati consecutivamente per un periodo di sei mesi (da aprile 2014 a settembre 2014) dal reparto ambulatoriale di parodontologia, Krishnadevaraya College of Dental Sciences, Bangalore e Karnataka. L'autorizzazione etica per lo studio è stata ottenuta dal comitato etico istituzionale (02-D012-36773). Lo studio è stato condotto in accordo con i principi etici descritti nella Dichiarazione di Helsinki 2008. La procedura dello studio è stata spiegata e il consenso scritto informato è stato ottenuto da tutti i partecipanti prima della loro inclusione nello studio. Tra questi, 24 pazienti con parodonto malato sono stati raggruppati in 12 pazienti con gengivite cronica e 12 pazienti con parodontite cronica, mentre 10 individui sani sono stati inclusi come controllo. I criteri di inclusione erano: pazienti con più o uguale a 14 denti funzionali, pazienti sistemicamente sani che non avevano ricevuto alcuna forma di terapia parodontale chirurgica e non chirurgica o ricevuto antibiotici o terapia antinfiammatoria non steroidea negli ultimi 6 mesi dello studio . La gengivite cronica è stata definita come una profondità di sondaggio (PD) inferiore o uguale a 4 mm e superiore al 25% dei siti con presenza di sanguinamento gengivale (BOP).15 La parodontite cronica è stata definita come avente profondità di sondaggio maggiore o uguale a 5 mm, RAL maggiore o uguale a 8 mm, con più o uguale al 10% di siti con BOP positivo e evidenza di perdita ossea determinata radiograficamente.16 I pazienti che si sono offerti volontari senza evidenza di malattia parodontale determinata dall'assenza di aumento di PD o AL sono stati considerati come gruppo di controllo sano.

Misure cliniche:

I parametri clinici sono stati misurati e valutati per tutti i denti esclusi i terzi molari, in tutti i sei siti per ciascun dente (mesio-buccale, disto-buccale, disto-linguale, medio-linguale e mesio-linguale). Questi parametri consistevano in profondità della tasca (PD), valutazione del sanguinamento gengivale, ovvero indice gengivale (GI), misurazione dicotomica dell'accumulo di placca sopragengivale, ovvero indice di placca (PI) e sanguinamento al sondaggio (BOP) alla base della fessura. Un esaminatore calibrato (MN) ha eseguito tutte le valutazioni e le misurazioni del paziente.

Raccolta e analisi dei campioni GCF:

In tutti e tre i gruppi, i campioni GCF sono stati raccolti al basale e 6 settimane dopo il trattamento. La selezione del sito si è basata sul punteggio più alto registrato per singolo sito nella cavità orale. Un singolo sito in ciascun soggetto che mostrava le peggiori manifestazioni infiammatorie (gengivite cronica) e il più alto livello di RAL (parodontite cronica) è stato selezionato per la raccolta del fluido crevicolare gengivale. Nel nostro studio, abbiamo selezionato un singolo sito in ciascun soggetto per evitare il raggruppamento di campioni da più siti, poiché la parodontite è una malattia specifica del sito. Prima della raccolta dei campioni GCF, la placca sopragengivale è stata rimossa con pellet di cotone evitando il contatto con la gengiva marginale. Strisce di carta standard sono state accuratamente inserite a una profondità di circa 2 mm nel solco/tasca per 30 secondi per la raccolta di GCF. Le strisce contaminate dal sangue sono state scartate ed è stato utilizzato un sito alternativo per ottenere campioni sostitutivi. Nei pazienti con gengivite cronica, è stato raccolto un campione alternativo con i successivi punteggi GI più alti e nei pazienti con parodontite cronica è stata selezionata la successiva profondità della tasca di sondaggio {PPD} per il sito di campionamento alternativo. È stato utilizzato un apparecchio calibrato per quantificare il volume del campione GCF e la lettura è stata convertita in volume effettivo (μL) facendo riferimento a una curva standard, preparata utilizzando la lettura del periotrone del volume di acqua distillata fluida (μL) in strisce perio-col. Una striscia vuota di raccolta del fluido gengivale (perio-col) è stata posizionata tra i metasensori del fluido periotron e lo strumento è stato regolato per visualizzare una lettura pari a zero. È stata utilizzata una siringa da microlitro per erogare accuratamente 0,25-1,25 μL di fluido (acqua distillata) alla striscia perio-col. Le strisce sono state immediatamente posizionate tra i sensori periotron. Il volume del punteggio del periotrone mostrava il volume noto di fluido registrato. Questo passaggio è stato ripetuto altre tre volte con 0,25 μL di fluido di prova e il punteggio medio è stato registrato. Il passaggio precedente è stato ripetuto utilizzando un volume di 0,5, 0,75, 1,0, 1,25 μL e in ogni caso il valore medio del periotrone calcolato e registrato. Una volta ottenuti tutti i punteggi, è stata calcolata una curva standard con il volume del fluido noto (asse X) e il punteggio del periotrone (asse Y). In modo simile i volumi GCF (dalla salute, gengivite cronica, parodontite cronica) dai pazienti dello studio sono stati ottenuti automaticamente con il punteggio del periotrone. L'interpolazione dal grafico di calibrazione standard ha fornito il volume del fluido. Dopo la misurazione del volume, le strisce dei siti selezionati sono state immediatamente collocate in singole provette per microcentrifuga contenenti 200 μL di soluzione tampone fosfato. I campioni sono stati conservati a -80 °C fino a ulteriori analisi.

ELISA

I livelli di IL-21 nel GCF sono stati determinati utilizzando ELISA secondo le istruzioni del produttore. Per eluire le proteine, la provetta contenente le strisce di periopaper è stata vortexata e omogeneizzata per 30 secondi e poi centrifugata a 12.500 rpm a 4°C per 5 minuti. Il kit utilizzava l'anticorpo monoclonale MT 21.3 biotina e lo standard IL-21 ricombinante umano (anticorpo catturato). I campioni sono stati analizzati in triplicato per autenticare la sensibilità dell'ELISA e tutti i campioni sono risultati entro il limite di rilevabilità dell'ELISA. Per misurare l'assorbanza del substrato è stato utilizzato un lettore ELISA (spectramax 190 Ab sorbance microplate reader; dispositivi molecolari; Sunnyvale, CA, USA) con 450 nm come lunghezza d'onda elementare. La conversione delle letture di assorbanza ottenute, in volume definito (pg/mL) è stata eseguita utilizzando la curva di riferimento standard. La concentrazione proteica in ciascun sito (pg/mL) è stata determinata dividendo la quantità totale di IL-21 (pg) per il volume del fluido crevicolare gengivale (μL) e successivamente i valori (pg/μL) sono stati convertiti in (pg/mL) .

Protocolli di trattamento parodontale:

Al basale, sono stati eseguiti i parametri clinici e la raccolta di campioni GCF per tutti i pazienti. Tutti i pazienti hanno ricevuto un'accurata igiene orale, un ablazione sopragengivale sottogengivale della bocca completa insieme alla levigatura radicolare. La terapia parodontale non chirurgica per il gruppo III è stata eseguita in 2-3 appuntamenti. Un singolo esaminatore calibrato (MN) ha fornito il trattamento a tutti i pazienti dello studio.

ANALISI STATISTICA:

La potenza dello studio e il calcolo della dimensione del campione sono stati determinati sulla base della variazione del livello di IL-21 GCF. Stime attuali come studio pilota che includeva 12 pazienti in ciascun gruppo di test e 10 nel gruppo di controllo con una dimensione totale del campione di 34 pazienti. È stato calcolato il livello di errore di tipo II di β = 0,20 (80% di potenza) e il livello di errore di tipo I di α = 0,05 (probabilità del 5%). È stata analizzata statisticamente la distribuzione dei campioni con i rispettivi valori di PI, GI, BOP, PD, RAL e livelli di IL-21 pre-operatori e post-operatori. I dati sono stati inseriti in Microsoft Excel e analizzati utilizzando il pacchetto SPSS {pacchetto statistico per le scienze sociali}, ver.10.05). Le proporzioni sono state confrontate utilizzando il test di significatività del test Chi-quadrato (χ2). La normalità dei dati è stata testata utilizzando il test di Shapiro-Wilk. È stato eseguito un t-test di Student per determinare i valori di differenza pre e post trattamento. Per testare la differenza tra i gruppi è stata utilizzata l'analisi della varianza unidirezionale (ANOVA). Il confronto dei parametri biochimici e clinici è stato eseguito utilizzando il test non parametrico di Kruskal-Wallis. P<0,05 è stato considerato statisticamente significativo.