Vliv nechirurgické parodontální terapie na hladiny interleukinu-21 v gingivální crevikulární tekutině

Úvod

Parodontální onemocnění je polymikrobiální onemocnění, které postihuje tkáně podporující zuby. Nedílnou součástí onemocnění parodontu je destrukce periodontálních tkání, která je důsledkem stimulace bakteriální výzvy hostitele imunitní-zánětlivé odpovědi. Chronická parodontitida je nejčastější formou onemocnění parodontu u dospělé populace. Biofilm bakteriálního plaku je primitivním faktorem parodontitidy, ale většina destrukce periodontálních tkání by nakonec vyplynula ze sekvence imunitních zánětlivých reakcí. V důsledku buněčné aktivace zánětlivé mediátory zahrnují cytokiny, chemokiny atd. společně přispívají k destrukci tkáně a kostní resorpci. Cytokiny lze seskupit jako Th1, Th2, Th17 a T regulační (Treg) na základě jejich expresního vzoru a účinků na cílové buňky nebo tkáně.5 Klasicky se periodontální onemocnění vysvětlovalo Th1/Th2 dráhou. Th1 buňky jsou častěji detekovány v časném stadiu periodontálních lézí, což naznačuje, že Th1 buňky jsou spojeny s ochrannou odpovědí proti bakteriální infekci, zatímco Th2 buňky převažují v pozdějším a pokročilém období onemocnění a mají roli v destrukci a progresi parodontu. léze. Alternativní typ reakce hostitele na patogenní bakterie byl popsán cestou IL-23/IL-17. K této alternativní cestě dochází, když bakterie indukují syntézu IL-23/17 spíše než IL-12, který hraje klíčovou roli při iniciaci a udržování zánětlivé odpovědi. Dráha IL-23/17 ve srovnání s klasickou Th1/Th2 dráhou je velmi jemně vyladěná buněčná imunitní odpověď, která má mnoho funkcí, které přemosťují vrozenou a adaptivní větev imunitní odpovědi.9 Cytokiny Th17 (IL-17, IL-21, IL-22, IL-6, Tumor nekrotizující faktor {TNF}-a atd.)8 se účastní onemocnění parodontu, ale zda je jejich dominantní role protektivní nebo destruktivní vůči hostiteli, je sporné . Tyto cytokiny nebyly objasněny při různém zánětlivém stavu u parodontitidy.

IL-21 je cytokin typu I, strukturálně se zdá podobný proteinům IL-2, IL-4 a IL-15. IL-21 je v zásadě složen z aktivovaných T buněk, ale řídí široké spektrum myeloidních a lymfoidních buněk imunitního systému, které usnadňují IL-21 modulovat získanou a vrozenou imunitu.10 IL-21 soutěží v imunitě proti nádorovým buňkám11 a chronickým virovým infekcím,12 však obrovský úspěch IL-21 koreluje s rozvojem imunitních zánětlivých onemocnění v různých orgánech.13 IL-21 je zvýšený u dermatologických stavů, jako jsou kožní biopsie14 pacientů se systémovým lupus erythematodes, psoriázou a atopickou dermatitidou. Interpretace IL-21 navíc odpovídá přítomnosti buněk Th17 v synoviální tekutině a periferní krvi pacientů s revmatoidní artritidou.

Role IL-21 při zánětu byla rozsáhle studována; aspekt léčby na jejích úrovních u periodontálních onemocnění je třeba dále prozkoumat. Proto ve světle výše uvedených zjištění vyšetřovatelé určují hladiny interleukinu-21 (IL-21) v GCF z chronické gingivitidy, chronické parodontitidy a kontrolních pacientů před a po nechirurgické periodontální terapii spolu se vzájemným vztahem klinické parametry destrukce parodontálních tkání.

MATERIÁLY A METODY:

PACIENTI:

Třicet čtyři pacientů (19 mužů a 15 žen, ve věku 20-60 let) bylo postupně zapsáno po dobu šesti měsíců (duben 2014 až září 2014) z ambulantního oddělení parodontologie, Krishnadevaraya College of Dental Sciences, Bangalore a Karnataka. Etické schválení pro studii bylo získáno od institucionální etické komise (02-D012-36773). Studie byla provedena v souladu s etickými principy popsanými v Helsinské deklaraci z roku 2008. Byl vysvětlen postup studie a byl získán informovaný písemný souhlas všech účastníků před jejich zařazením do studie. Mezi nimi bylo 24 pacientů s nemocným parodontem seskupeno do 12 pacientů s chronickou gingivitidou a 12 pacientů s chronickou parodontitidou, zatímco 10 zdravých jedinců bylo zahrnuto jako kontrola. Kritéria pro zařazení byla: pacienti, kteří mají více než nebo rovných 14 funkčních zubů, systémově zdraví pacienti, kteří během posledních 6 měsíců od studie nepodstoupili žádnou formu chirurgické a nechirurgické parodontální terapie nebo dostávali antibiotika nebo nesteroidní protizánětlivou terapii . Chronická gingivitida byla definována jako hloubka sondy (PD) menší nebo rovna 4 mm a více než 25 % míst s přítomným krvácením z dásní (BOP).15 Chronická parodontitida byla definována jako s hloubkou sondy větší nebo rovnou 5 mm, RAL větší nebo rovnou 8 mm, s více než nebo rovnými 10 % míst s pozitivním BOP a průkazem ztráty kostní hmoty stanoveným rentgenologicky.16 Za zdravou kontrolní skupinu byli považováni pacienti, kteří se dobrovolně přihlásili bez známek periodontálního onemocnění určeného nepřítomností zvýšené PD nebo AL.

Klinická měření:

Klinické parametry byly měřeny a hodnoceny u všech zubů kromě 3. molárů na všech šesti místech pro každý zub (mezio-bukální, disto-bukální, disto-lingvální, střední lingvální a mesiolingvální). Tyto parametry sestávaly z hloubky kapsy (PD), hodnocení gingiválního krvácení, tj. gingiválního indexu (GI), dichotomického měření supragingiválního hromadění plaku, tj. indexu plaku (PI) a krvácení při sondování (BOP) do spodiny štěrbiny. Jeden kalibrovaný vyšetřující lékař (MN) provedl všechna hodnocení a měření pacientů.

Sběr a analýza vzorků GCF:

Ve všech třech skupinách byly vzorky GCF odebrány na začátku a 6 týdnů po léčbě. Výběr místa byl založen na nejvyšším skóre zaznamenaném pro jedno místo v dutině ústní. Pro odběr gingivální štěrbinové tekutiny bylo vybráno jedno místo u každého subjektu, které vykazovalo nejhorší zánětlivé projevy (chronická gingivitida) a nejvyšší hladinu RAL (chronická parodontitida). V naší studii jsme u každého subjektu vybrali jedno místo, abychom se vyhnuli shromažďování vzorků z více míst, protože parodontitida je místně specifické onemocnění. Před odběrem vzorků GCF byl odstraněn supragingivální plak bavlněnými peletami, aby se zabránilo kontaktu s marginální gingivou. Standardní papírové proužky byly opatrně vloženy do hloubky přibližně 2 mm do sulcus/kapsy po dobu 30 sekund pro sběr GCF. Proužky kontaminované krví byly zlikvidovány a k získání náhradních vzorků bylo použito alternativní místo. U pacientů s chronickou gingivitidou byl odebrán alternativní vzorek s dalším nejvyšším GI skóre au pacientů s chronickou parodontitidou byla pro alternativní místo vzorku vybrána další nejhlubší hloubka sondovací kapsy {PPD}. Ke kvantifikaci objemu vzorku GCF bylo použito kalibrované zařízení a odečtené hodnoty byly převedeny na skutečný objem (μl) odkazem na standardní křivku, připravenou pomocí periotronového odečítání objemu tekutiny (μl) destilované vody v perio-col stripech. Prázdný proužek pro odběr gingivální tekutiny (perio-col) byl umístěn mezi periotronové meta senzory a přístroj byl nastaven tak, aby zobrazoval hodnotu nula. Mikrolitrová injekční stříkačka byla použita k přesné aplikaci 0,25-1,25 μl tekutiny (destilované vody) na perio-col strip. Proužky byly okamžitě umístěny mezi periotronové senzory. Objem periotronového skóre zobrazoval známý objem zaznamenané tekutiny. Tento krok byl opakován ještě třikrát s 0,25 μl testovací tekutiny a bylo zaznamenáno průměrné skóre. Výše uvedený krok byl opakován s použitím objemu 0,5, 0,75, 1,0, 1,25 ul a v každém případě byla vypočtena a zaznamenána střední hodnota periotronu. Jakmile byla získána všechna skóre, byla vypočtena standardní křivka se známým objemem tekutiny (osa X) a periotronovým skóre (osa Y). Podobným způsobem byly automaticky získány objemy GCF (ze zdraví, chronická gingivitida, chronická parodontitida) od studovaných pacientů s periotronovým skóre. Interpolace ze standardního kalibračního grafu poskytla objem tekutiny. Po změření objemu byly proužky z vybraných míst ihned umístěny do jednotlivých mikrocentrifugačních zkumavek obsahujících 200 μl roztoku fosfátového pufru. Vzorky byly skladovány při -80 °C až do další analýzy.

ELISA

Hladiny IL-21 v GCF byly stanoveny pomocí ELISA podle pokynů výrobce. Pro eluci proteinů byla zkumavka obsahující periopaperové proužky vortexována a homogenizována po dobu 30 sekund a poté centrifugována při 12 500 otáčkách za minutu při 4 °C po dobu 5 minut. Souprava používala monoklonální protilátku MT 21.3 biotin a lidský rekombinantní IL-21 standard (zachycená protilátka). Vzorky byly testovány v triplikátech pro ověření citlivosti ELISA a bylo zjištěno, že všechny vzorky jsou v detekčním limitu ELISA. K měření absorbance substrátu byla použita čtečka ELISA (spektramax 190 Ab sorbance microplate reader; molekulární zařízení; Sunnyvale, CA, USA) s 450 nm jako elementární vlnovou délkou. Převod získaných hodnot absorbance na konečný objem (pg/ml) byl proveden pomocí standardní referenční křivky. Koncentrace proteinu na každém místě (pg/ml) byla stanovena vydělením celkového množství IL-21 (pg) objemem gingivální štěrbinové tekutiny (μL) a následně byly hodnoty (pg/μL) převedeny na (pg/ml). .

Protokoly ošetření parodontu:

Na začátku byly provedeny klinické parametry a odběr vzorků GCF pro všechny pacienty. Všichni pacienti dostali důkladné instrukce o ústní hygieně, supragingivální subgingivální škálování plných úst spolu s hoblováním kořenů. Nechirurgická parodontologická terapie pro skupinu III byla provedena ve 2-3 termínech. Jediný kalibrovaný vyšetřující lékař (MN) poskytoval léčbu všem pacientům ve studii.

STATISTICKÁ ANALÝZA:

Síla studie a výpočet velikosti vzorku byly stanoveny na základě změny hladiny GCF IL-21. Současné odhady jako pilotní studie, která zahrnovala 12 pacientů v každé testované skupině a 10 v kontrolní skupině s celkovou velikostí vzorku 34 pacientů. Byla vypočtena úroveň chyby typu II β = 0,20 (80% síla) a úroveň chyby typu I α=0,05 (5% pravděpodobnost). Statisticky bylo analyzováno rozdělení vzorků s příslušnými hodnotami PI, GI, BOP, PD, RAL a IL-21 předoperačně a pooperačně. Data byla zadána v Microsoft Excel a analyzována pomocí SPSS {statistical package for social science}, ver.10.05). Proporce byly porovnány pomocí testu významnosti Chí-kvadrát (χ2). Normalita dat byla testována pomocí Shapiro-Wilkova testu. Byl proveden studentský t-test, aby se určily rozdílové hodnoty před a po léčbě. K testování rozdílu mezi skupinami byla použita jednosměrná analýza rozptylu (ANOVA). Porovnání biochemických a klinických parametrů bylo provedeno pomocí Kruskal-Wallisova neparametrického testu. P<0,05 bylo považováno za statisticky významné.