Ocena poziomu i znaczenia prognostycznego nowych markerów stanu zapalnego układu nerwowego w krwotoku podpajęczynówkowym (ESA-MICROPN)

Krwotok podpajęczynówkowy (SAH) polega na wynaczynieniu krwi do przestrzeni między pajęczynówką a oponą miękką. Krwawienie jest najczęściej konsekwencją pęknięcia tętniaka mózgu. Dotyczy to zwłaszcza kobiet, których średni wiek wynosi 55 lat. Mimo, że zapadalność wynosi zaledwie 9 przypadków na 1000 osób rocznie, młody wiek oraz wysoka śmiertelność i zachorowalność prowadzą do utraty kilku lat zdrowego życia. W rzeczywistości pacjenci, którzy przeżyli pęknięcie tętniaka mózgu, cierpią na deficyty poznawcze, zaburzenia zachowania i nie są w stanie wrócić do dawnej produktywności i pracy. Priorytetami terapeutycznymi są: zapobieganie nawrotom krwawień, z leczeniem wewnątrznaczyniowym (jeśli to możliwe) lub neurochirurgicznym zacięciem tętniaka; zapobieganie powikłaniom związanym z wynaczynieniem krwi do rytmu podpajęczynówkowego, takim jak leczenie ostrego wodogłowia (występujące u 20% pacjentów), poprzez ułożenie drenażu zewnętrznego komór oraz opóźnionego niedokrwienia mózgu, głównie na skutek skurczu naczyń, poprzez dożylne podanie nimodypiny; optymalne utrzymanie ciśnienia perfuzyjnego. Z patofizjologicznego punktu widzenia, po wczesnym uszkodzeniu mechanicznym, spowodowanym pęknięciem tętniaka (w wyniku zniszczenia tkanki w następstwie efektu masy krwotocznej, ostrego wodogłowia, przepukliny lub ewentualnego krwiaka śródmiąższowego) uszkodzenie podostre mogło rozwinąć się od trzech do czternastu dni po krwotoku z powodu opóźnionego niedokrwienia mózgu. Główną przyczyną tego zdarzenia jest skurcz naczyń, który wikła 20-30% SAH, dysfunkcja mikrokrążenia i mikrozakrzepica. Patogeneza uszkodzeń wtórnych nie jest jasna, ale wykazano, że zapalenie i apoptoza śródbłonka są zaangażowane w rozwój skurczu naczyń. Co więcej, niektóre badania pokazują, że pacjenci z ostrą dysfunkcją neurologiczną mają większe ryzyko niewydolności narządów, zwłaszcza płuc i nerek.

Osteopontyna (OPN) jest wydzielaną glikoproteiną macierzy zewnątrzkomórkowej, która odgrywa kilka ról w procesach fizjologicznych i patologicznych, takich jak przebudowa tkanek, zwłóknienie, migracja komórek, hamowanie apoptozy i zapalenie. Uważa się, że endogenna OPN pełni funkcję ochronną przed uszkodzeniem niedokrwiennym zarówno mózgu, jak i innych narządów, w tym nerek. Poza tym podawanie rekombinowanej OPN znacznie zmniejsza obszar niedokrwienia w modelu ogniskowego niedokrwienia mózgu, poprzez działanie antyapoptotyczne. Niedawne badania in vivo na modelach zwierzęcych SAH wykazały, że główną rolę odgrywa OPN; jego podawanie osłabia uszkodzenie mózgu, zmniejszając metaloproteinazę 9 i hamując indukowalną syntazę tlenku azotu. Leczenie OPN wydaje się również zapobiegać skurczowi naczyń, indukując endogenny inhibitor białka aktywowanego mitogenem (MAP), tj. kinazy MAP fosfatazy 1 oraz zmniejszania apoptozy komórek mięśni gładkich i komórek śródbłonka. Kolejnym polem badawczym w tym obszarze są mikrocząsteczki, czyli mediatory uwalniane przez płytki krwi, leukocyty, erytrocyty i komórki śródbłonka. Wbrew temu, co do tej pory sądzono, nie stanowią one formy materiału odpadowego z apoptotycznych komórek krzepnięcia, a ostatnie badania wykazują ich parakrynną i regulacyjną aktywność. W udarze niedokrwiennym poziomy mikrocząstek śródbłonka są bezpośrednio związane z ciężkością kliniczną i zasięgiem obszaru niedokrwienia. W typowym krwotoku miąższowym stężenie mikrocząsteczek jest wyższe zarówno we krwi, jak i w płynie, co wiąże się z gorszym rokowaniem klinicznym. W SAH wykazano zwiększone poziomy mikrocząstek, zwłaszcza w dniu krwawienia, a poziomy mikrocząstek zmieniają się w zależności od rodzaju. Z drugiej strony dane nie zgadzają się między artykułami co do typów związanych z fluktuacjami i ich przebiegiem w czasie: Lackner et al. ocenili 20 pacjentów z SAH (Fisher II, III i IV) w ciągu pierwszych piętnastu dni od krwawienia i stwierdzili wyższy poziom mikrocząsteczek płytek krwi, śródbłonka, erytrocytów i leukocytów w porównaniu ze zdrowymi osobami z grupy kontrolnej [28]. Ponadto typ śródbłonka dodatni dla markerów klastra różnicowania (CD) 105 i CD 62 był szczególnie podwyższony u pacjentów dotkniętych skurczem naczyń, udokumentowanym metodą dopplerowską. Niedokrwienie związane ze skurczem naczyń również charakteryzuje się szczególnie wysokimi poziomami mikrocząstek płytkowych CD 41-dodatnich. Niezależnie od stopnia niesprawności w momencie wypisu, poziomy mikrocząsteczek są wyższe w porównaniu do pacjentów w pełni wyleczonych (n=11). Niedawno Sanborn i in. badanie na 22 pacjentach z SAH z masywnym rozsiewem krwi (Fisher III i IV) potwierdza poziomy podwyższenia mikrocząsteczek u tych pacjentów. Weryfikuje się również podwyższenie poziomu mikrocząstek śródbłonka i płytek krwi, natomiast nie stwierdza się korelacji z objawami skurczu naczyń, zarówno w ultrasonografii (średnia prędkość powyżej 125 cm/s w krążeniu przednim lub powyżej 100 cm/s w krążeniu tylnym, oprócz wskaźnik Lindegaarda wyższy niż 3) i angiografia.

Opublikowane dane nie są jednoznaczne ani co do korelacji między skurczem naczyń a tomografią komputerową świadczącą o niedokrwieniu lub niesprawności.

Pierwszorzędowym punktem końcowym badania jest ocena:

1) korelacja między poziomem OPN i mikrocząstkami a rozwojem skurczu naczyń/zmiany niedokrwiennej w tomografii komputerowej, a następnie ze średnio- i długoterminowymi wynikami pacjentów.

Drugorzędowymi punktami końcowymi były:

1. Zmiany ilości OPN w płynie i krwi pacjentów z SAH w dniu krwawienia i po krwotoku tj. w dniach 1, 2, 3, 5, 7, 9, 11.
2. Stężenia mikrocząstek w płynach i we krwi pacjentów z SAH w dniu krwawienia i po krwotoku, tj. w dniach 1, 2, 3, 5, 7, 9, 11, w celu oceny zarówno ich wartości predykcyjnej dla skurczu naczyń, jak i korelacji z nerkami lub pogorszenie funkcji płuc i wynik 3-6 miesięcy.
3. Wyizolowane mikrocząsteczki zostaną wykorzystane do aktywacji komórek śródbłonka nerki i płuc in vitro w celu wykrycia ewentualnego przesłuchu, analizy markerów uszkodzenia śródbłonka.

Rekrutacja potrwa rok. Przy przyjęciu do szpitala zostanie wykonane badanie CT, a także ocena Fischera, ocena Hunta i Hessa oraz ocena Światowej Federacji Chirurgów Neurologicznych (WFNS). Zarejestrujemy zmienne demograficzne tj. wiek, płeć, objawy na początku choroby oraz współzachorowalność.

Angiografia lub angio-TK zostanie przeprowadzona zgodnie z najlepszą praktyką kliniczną w celu udokumentowania obecności, wymiarów i charakterystyki przetrwałego tętniaka. Leczenie pacjentów z SAH będzie prowadzone zgodnie z rutynową najlepszą praktyką kliniczną. Pacjenci będą monitorowani przezczaszkowym badaniem dopplerowskim począwszy od dnia I i klinicznie każdego dnia. Jeśli nie nastąpi żadna zmiana kliniczna, pacjenci zostaną poddani angiografii perfuzyjnej lub angiografii CT w dniu 7 (+/- 1 dzień). W przypadku pogorszenia stanu klinicznego lub wzrostu prędkości dopplerowskiej (uznając skurcz naczyń za łagodny, gdy średnia prędkość w tętnicy mózgowej 120-150 cm/s, umiarkowana 150-200 cm/s i ciężka >200 cm/s) rozważona zostanie angiografia i wewnątrznaczyniowe nimodypina zgodnie z zaleceniami do standardowego protokołu terapii. Skurcz naczyń angiograficznych polega na zwężeniu tętnic mózgowych potwierdzonym przez neuroradiologa. Kliniczny skurcz naczyń definiowany jest jako pogorszenie świadomości (obniżka o 2 punkty w skali Glasgow (GCS)) i/lub pojawienie się nowego ubytku ogniskowego, po wykluczeniu innych przyczyn, takich jak drgawki, ponowne krwawienia, gorączka. Każdy nowy dowód niedokrwienia w tomografii komputerowej będzie rejestrowany od dnia 3.

Po 3-6 miesiącach wynik zostanie oceniony za pomocą GOS-E (Extended Glasgow Coma Scale; 8-punktowa skala, od zgonu do górnego dobrego powrotu do zdrowia, bez jakiejkolwiek niepełnosprawności związanej z SAH). Aby uzyskać te informacje, przeszkolony personel przeprowadzi wywiad z samym pacjentem lub z jego bliskim krewnym.

Materiał biologiczny zostanie pobrany przy przyjęciu, czyli w ciągu 24 godzin od krwawienia oraz w dniach 1, 2, 3, 5, 7, 9, 11. Sterylna ciecz będzie pobierana z worka dystalnie do komory zbierającej w ilości 10 ml/matrycę, każdego dnia o tej samej porze. Krew w ilości 3 ml/matrycę oraz mocz będą pobierane w tym samym czasie (około godz. 7:00). Płyn, osocze i mocz będą wirowane (2500 obrotów na minutę przez 30 minut), a supernatanty będą dzielone na porcje i zamrażane w temperaturze -80°C do czasu analizy. Analiza OPN zostanie przeprowadzona za pomocą komercyjnego zestawu do testu immunoenzymatycznego (ELISA), zgodnie z sugestią producenta (AssayDesigns Inc., Michigan; Pierce Biotechnology Inc., Rockford, IL). Aby lepiej opisać odpowiedź zapalną, zmierzone zostaną główne cytokiny T pomocnicze 1 (Th)1 i Th2, a także markery uszkodzenia mózgu (enolaza specyficzna dla neuronów (NSE), asymetryczna dimetyloarginina (ADMA) itp.). W moczu zostaną określone ilościowo markery wczesnego upośledzenia przedklinicznego. Izolacja i charakterystyka mikrocząstek zostanie przeprowadzona za pomocą Nanosight na podstawie wymiarów i stężenia, podczas gdy główne antygeny powierzchniowe zostaną zidentyfikowane w cytofluorymetrii, określając pochodzenie: leukocyty, erytrocyty, płytki krwi, komórki śródbłonka. Analiza in vitro zostanie przeprowadzona na jednowarstwowych komórkach śródbłonka nerki i płuc. Bilans wodny, kreatynina, liczba leukocytów, infekcja/kolonizacja, leki nefrotoksyczne będą monitorowane codziennie.

Działanie mikrocząstek zostanie ocenione in vitro na komórkach śródbłonka pępowiny (HUVEC), komórkach mięśni gładkich (SMC), komórkach śródbłonka płuc i nerek, inkubowanych z oczyszczonymi mikrocząstkami pochodzącymi z osocza pacjentów i bez nich. Ponadto zostanie przeprowadzona analiza w celu oceny: apoptozy (barwienie tunelowe), angiogenezy (występowanie struktur przypominających naczynia włosowate na płytce Matrigen), adhezji leukocytów i ekspresji cząsteczek adhezyjnych.

Ponieważ w literaturze nie ma danych na temat poziomów OPN podczas SAH, a dane dotyczące mikrocząstek nie są jednomyślne, nie obliczono rzeczywistej wielkości próby. Biorąc pod uwagę, że u 20%-30% pacjentów spodziewano się powikłań związanych ze skurczem naczyń, zaplanowano rekrutację 60 pacjentów w ciągu jednego roku, aby uzyskać 12-18 pacjentów ze skurczem naczyń. Uczestnicy spełniający kryteria włączenia i wyłączenia zostaną zapisani zarówno na OIOM, jak i na Oddział Neurochirurgii Novara Ospedale Maggiore della Carità w okresie jednego roku (tj. 31 stycznia 2018 r., 30 stycznia 2019 r.). Na podstawie przyjętych w ubiegłym roku spodziewanych jest 20 pacjentów na OIT i 40 pacjentów na oddziale neurochirurgii. W T0 poziomy mikrocząstek będą analizowane u pacjentów ze skurczem naczyń i bez niego za pomocą testu rang Wilcoxona. Za pomocą uogólnionych równań parowych poziomy mikrocząstek zostaną porównane między pacjentami ze skurczem naczyń lub nowymi zdarzeniami niedokrwiennymi i bez nich. 3 i 6 miesięcy GOS-E zostanie porównany za pomocą testu Kruskala-Wallisa. Zależność między liczbą mikrocząstek a występowaniem skurczu naczyń i niedokrwienia zostanie określona za pomocą korelacji Spearmana. Wartość p mniejsza niż 0,05 będzie progiem istotności statystycznej. Analiza zostanie przeprowadzona za pomocą STATA. W przypadku doświadczeń in vitro zostaną przeprowadzone badania nieparametryczne.